季宏建孫劍華

(1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，鹽城 224005；2.鹽城市第三人民醫(yī)院 藥學(xué)部，鹽城 224005)

高效液相色譜法(HPLC)具有其他色譜法無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，具有檢測(cè)速度快、分離效能高、檢測(cè)靈敏度高、選擇性好、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)[1，2]，廣泛應(yīng)用于食品、藥品檢測(cè)和臨床分析等方面[3-5]。流動(dòng)相、固定相是決定物質(zhì)能否被高效分離的關(guān)鍵因素。本文從影響流動(dòng)相和固定相的各因素(物理因素、化學(xué)因素)入手，詳細(xì)研究了高效液相色譜的維護(hù)方法。

1 與流動(dòng)相相關(guān)的研究?jī)?nèi)容

1.1 外部因素(物理因素)對(duì)流動(dòng)相的影響

1.1.1儲(chǔ)液瓶

流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶是一個(gè)簡(jiǎn)單但很重要的HPLC部件。首先，儲(chǔ)液瓶的材質(zhì)需要對(duì)流動(dòng)相保持惰性。液相用的大部分儲(chǔ)液瓶是由玻璃制成，因此實(shí)驗(yàn)室的玻璃器皿，厚玻璃瓶等都可以作為儲(chǔ)液瓶，但是基于流動(dòng)相防塵、防污染、防真空等要求，必須提供為液相色譜特殊設(shè)計(jì)的儲(chǔ)液瓶。儲(chǔ)液瓶需要用蓋子之類(lèi)的物品保護(hù)，免受灰塵的污染，以及減少流動(dòng)相的揮發(fā)。但同時(shí)蓋子也不能蓋得太緊，否則在流動(dòng)相泵出時(shí)易產(chǎn)生容器內(nèi)真空，導(dǎo)致斷流。

1.1.2過(guò)濾

如果HPLC系統(tǒng)中存在顆粒雜質(zhì)，那么系統(tǒng)的比例閥、單向閥、管路、色譜柱、進(jìn)樣閥等都無(wú)法良好運(yùn)行，并會(huì)導(dǎo)致磨損，因此，使用沒(méi)有顆粒雜質(zhì)的流動(dòng)相是基本要求。市售的HPLC級(jí)的溶劑和實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備的HPLC級(jí)別水，使用前要通過(guò)0.45μm 或0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾。流動(dòng)相中加入了其他組分(例如緩沖鹽、離子對(duì)試劑等)，也是必須要過(guò)0.45μm 或0.22μm的微孔濾膜的。

1.1.3脫氣

只要空氣在流動(dòng)相里保持溶解，氣泡問(wèn)題就很少會(huì)出現(xiàn)，但若是被氣體飽和的溶液，只要非常小的壓力下降就能導(dǎo)致氣泡逸出。以純水和純甲醇為例，若它們被暴露在空氣中，就會(huì)分別被空氣飽和，而空氣在甲醇/水混合溶劑里面的溶解度與甲醇濃度有關(guān)，低于其在甲醇和水中溶解度之和，當(dāng)兩種溶劑混合后，混合液中氣體會(huì)過(guò)飽和，便迅速以氣泡形式逸出。因此，為了增加HPLC操作的可靠性，必須以適當(dāng)?shù)姆椒?超聲波脫氣、過(guò)濾脫氣、在線脫氣等)對(duì)流動(dòng)相脫氣。

1.1.4保存期限

配好的流動(dòng)相都有一定的保存期限，因此為避免流動(dòng)相變質(zhì)而導(dǎo)致浪費(fèi)，建議根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況和有效期，合理配制一次所需的用量。在將配制好的新鮮流動(dòng)相倒入儲(chǔ)液瓶前，需先將儲(chǔ)液瓶潤(rùn)洗3次。然后把填寫(xiě)好的《儲(chǔ)液瓶標(biāo)簽》(內(nèi)容包括流動(dòng)相成分、配比、配制人、配制日期及有效期等信息)粘貼到儲(chǔ)液瓶上。

1.2 內(nèi)部因素(化學(xué)因素)對(duì)流動(dòng)相的影響

1.2.1pH值的影響

流動(dòng)相的pH值應(yīng)控制在2～7之間。當(dāng)pH值大于7時(shí)可使硅膠載體溶解；當(dāng)pH值小于2時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用pH值大于7的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐堿的填充劑；當(dāng)需使用pH值小于2的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐酸的填充劑。

1.2.2緩沖鹽的水相溶液的影響

含有緩沖鹽的流動(dòng)相應(yīng)盡可能少用，必須使用時(shí)，緩沖鹽的濃度應(yīng)盡可能低，否則容易阻塞管路。由于十八烷基鏈在純水相溶液中易產(chǎn)生彎曲，所以對(duì)于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中水相溶液的比例通常應(yīng)低于95%，否則C18鏈的隨機(jī)彎曲將引起組分保留值變化，導(dǎo)致色譜系統(tǒng)的重現(xiàn)性很差。

1.2.3流動(dòng)相的組成比例、變化幅度的影響

流動(dòng)相的成份不能隨意改變，但是比例可適當(dāng)調(diào)整。每次調(diào)整流動(dòng)相組成比例時(shí)，以組分比例較低者(小于或等于50%)相對(duì)改變量不超過(guò)±30%且絕對(duì)改變量不超過(guò)±10%為宜，如40%相對(duì)改變量的數(shù)值超過(guò)30%時(shí)，則絕對(duì)改變量以±10%為宜。

2 與固定相(色譜柱)相關(guān)的研究?jī)?nèi)容

2.1 影響色譜柱使用壽命的原因

2.1.1色譜柱篩板問(wèn)題

篩板位于色譜柱的入口處，容易發(fā)生堵塞。篩板堵塞會(huì)產(chǎn)生柱壓升高、色譜峰拖尾、塔板數(shù)降低等問(wèn)題。樣品中含有微粒是導(dǎo)致篩板堵塞的主要原因。因此，為了避免此類(lèi)問(wèn)題的發(fā)生，必須在進(jìn)樣前將樣品過(guò)0.45μm的濾膜。

2.1.2強(qiáng)保留樣品組分

強(qiáng)吸附性的樣品組分吸附在柱頭填料上，能?chē)?yán)重地縮短色譜柱壽命。分析生物組織或體液(如血漿)的提取物、含油劑等復(fù)雜樣品時(shí)，這種滯留組分的影響尤其嚴(yán)重。色譜柱應(yīng)用中，色譜峰嚴(yán)重拖尾或分叉的出現(xiàn)往往是強(qiáng)保留污染物在柱頭吸附的體現(xiàn)。在進(jìn)樣閥與色譜柱之間加/支保護(hù)性的小預(yù)柱，能夠有效減少?gòu)?qiáng)吸附組分對(duì)色譜柱的污染。小預(yù)柱通常為填充良好的1～2cm的短柱，內(nèi)裝有與色譜柱相當(dāng)?shù)奶盍?。需要注意的是小預(yù)柱必須定期更換。

2.2 色譜柱的清洗與再生

2.2.1反相色譜柱的清洗與再生

常規(guī)樣品污染的硅膠基質(zhì)色譜柱，一般選用溶劑強(qiáng)度逐漸增大(極性逐漸減弱)的溶劑清沖洗，強(qiáng)疏水性的溶劑清洗非極性物質(zhì)，如脂類(lèi)。最常用的方法是用20倍柱體積(柱體積指色譜柱內(nèi)空腔體積，4.6x250mm色譜柱的柱體積為4.2mL)的乙腈 (或甲醇)∶水=90∶10(V/V) →乙腈→二氯甲烷→乙腈→乙腈(或甲醇)∶水=90∶10(V/V)沖洗色譜柱。需要注意的是在清洗和再生的過(guò)程中，需要保證每種清洗溶劑和下一種清洗溶劑互溶。當(dāng)金屬離子污染色譜柱后，必須使用特殊的溶劑(磷酸和0.1mol/L檸檬酸)清洗色譜柱，才能得到再生。

2.2.2正相色譜柱的清洗與再生

正相色譜柱的清洗與再生的方法與反相色譜柱相反，用極性逐漸增強(qiáng)的溶劑沖洗。常用的方法正己烷→異丙醇→二氯甲烷→甲醇→二氯甲烷→異丙醇→正己烷沖洗，每種溶劑不少于20倍柱體積。

3 結(jié)語(yǔ)

在HPLC的使用過(guò)程中，務(wù)必做到一絲不茍，對(duì)儀器運(yùn)行時(shí)的各種數(shù)據(jù)及時(shí)記錄，這是對(duì)維護(hù)儀器的最重要的資源。在診斷儀器故障時(shí)，可應(yīng)用單因素交替法，配合零部件替代法，迅速查出故障所在，并進(jìn)行維護(hù)。總之，要想使HPLC處于高效運(yùn)行狀態(tài)，務(wù)必做好試樣的前期處理，同時(shí)務(wù)必做好儀器的正確使用和維護(hù)。