馬亞云, 龍海濤, 杜明遠, 薛華麗, 南米娜, 付國瑞, 畢 陽, 蒲陸梅*

1.甘肅農(nóng)業(yè)大學理學院, 蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院, 蘭州 730070

葡萄(Vitisvinifera)是維生素和礦物質(zhì)元素的極佳來源，近年來，葡萄汁等葡萄產(chǎn)品的消費量持續(xù)增長。葡萄作為世界上種植面積最大的水果作物之一，其中大部分被用于生產(chǎn)葡萄汁及深加工，然而，在葡萄的生產(chǎn)及貯存過程中經(jīng)常檢測到棒曲霉素(patulin，PAT)，其為棒曲霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1]，既具有致癌、致畸作用，又具有免疫毒性[2]，會給人體帶來嚴重的健康問題。世界糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會設定PAT每日最大攝入量為0.4 mg/kg[3]；歐盟規(guī)定在嬰幼兒蘋果制品中PAT應低于10 μg/kg[4]；而我國GB 2761-2017《食品安全國家標準——食品中真菌毒素限量》中規(guī)定水果、飲料及其制品中的PAT檢測限為50 μg/kg[5]。由此可見，尋找可有效降解食品中棒曲霉素的方法至關重要。

為了降低食品中棒曲霉素的含量，除了對加工原料進行清洗防腐處理，研究人員還開展了大量的研究工作。如利用活性炭、大孔樹脂、殼聚糖或硫脲改性的殼聚糖樹脂(thiourea modified chitosan resin，TMCR)[6,7]等吸附污水或水溶液中的污染物；近年來興起的印記材料也可用于對蘋果汁進行吸附澄清處理，24 h即可使蘋果汁中棒曲霉素的含量降低80%[8]。但上述物理吸附只是轉(zhuǎn)移了蘋果汁中的棒曲霉素，并未將其實質(zhì)降解或消除。輻照處理也可以減少蘋果汁中PAT的含量，但高輻照強度會破壞蘋果汁的品質(zhì)?；瘜W降解法雖在一定程度上消除了PAT的毒性，但所用試劑及衍生物亦可能嚴重影響蘋果汁的品質(zhì)，同時會對環(huán)境造成污染[9]。生物處理方法中，附生酵母(Rhodosporidiumkratochvilovaestrain LS11)既可控制蘋果中的棒曲霉，又對其產(chǎn)生的棒曲霉素具有生物降解能力，處理3 d后，可將90%以上的棒曲霉素降解，但其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(desoxypatulinic acid)仍繼續(xù)存在[10]，所以目前還難以得到廣泛應用。

輝光放電等離子體(glow discharge plasma，GDP)是一種新興的降解有機污染物的方法[11]，近年來引起了研究人員的廣泛關注。該方法將GDP的高能活性粒子作用于具有特定基團的有機物，通過破壞有機物分子中的化學鍵而使其逐步降解，最終將有機物降解為CO2和H2O，對于難降解的有機物具有較好的效果[12,13]，如其在有機染料[14]、苯酚和多取代酚[15,16]、苯胺和多取代苯胺[17,18]的降解中展現(xiàn)出了范圍廣且效率高的特點。然而，利用GDP直接針對葡萄汁中PAT的降解及其對葡萄汁品質(zhì)的影響的相關研究鮮見報道。

因此，本研究以不同電壓、處理時間、PAT初始濃度及催化劑為因素，研究GDP對葡萄汁中棒曲霉素的降解工藝及動力學特征，并對GDP處理前后葡萄汁的營養(yǎng)品質(zhì)進行比對分析，旨在為研究利用GDP降解果汁飲料中棒曲霉素提供一定的理論依據(jù)，同時對果汁的飲用安全也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1材料與試劑 “巨峰”紫葡萄于2017年7月采自甘肅省天水市麥積區(qū)社棠鎮(zhèn)；棒曲霉素標準品購于北京泰樂祺科技有限公司；福林酚購自合肥博美生物科技有限公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2儀器與設備 3K-15高速冷凍離心機(美國Sigma公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；DH1722-6高壓直流電源(北京大華無線電儀器廠)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南省予華儀器有限公司)；RE2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；FL2200-2高效液相色譜儀(浙江福立分析儀器有限公司)；PHS-3C pH計(上海雷磁儀器廠)；722N可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；2W型阿貝折光儀(上海光學儀器五廠)。

1.1.3輝光放電裝置 輝光放電試驗裝置的構造如圖1所示，該裝置主要包括反應器和直流電源2個部分。反應器分別由直徑為0.5 mm的鉑絲構成陽極，直徑為1.0 cm的碳棒構成陰極。反應過程中用水浴控制溫度，用磁力攪拌器進行攪拌。

圖1 GDP試驗裝置示意圖Fig.1 Experimental apparatus of GDP.

1.2 樣品制備

1.2.1棒曲霉素標準品 取1 mg的棒曲霉素標準品用乙腈溶解并定容至10 mL，得到100 mg/L的PAT標準儲備液，于-20℃保存，備用。

1.2.2葡萄汁的制備 選取顆粒完整、大小一致的“巨峰”紫葡萄，制備流程為：清洗→去梗、去皮→榨汁→3層紗布過濾→果膠酶酶解(加酶量0.05 g/L，于45℃處理2 h)→離心(4℃、6 000 r/min離心5 min)→抽濾，并將最終獲得的葡萄汁于4℃保存，備用。

1.2.3含棒曲霉素葡萄汁的制備 分別將3 mL、5 mL、7 mL 100 mg/L的PAT移至100 mL的容量瓶中，用1.2.2中制備的葡萄汁進行定容，分別得到3 mg/L、5 mg/L、7 mg/L的含PAT葡萄汁，于4℃保存，備用。

1.3 PAT標準曲線繪制

將100 mg/L的PAT標準儲備液分別用pH 4.0的乙酸稀釋成濃度為0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、5 mg/L以及10 mg/L的PAT溶液，再利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)進行檢測，以PAT濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制PAT標準曲線，得峰面積與PAT濃度為線性關系：y=89 720x+5 896.7，相關系數(shù)R2=0.997。

1.4 電流電壓特征曲線測定

取20 mL含PAT(初始濃度為5 mg/L)的葡萄汁于GDP反應器中，測定輝光放電發(fā)生時電流隨電壓的變化曲線。根據(jù)輝光放電穩(wěn)定狀態(tài)，確定適用于GDP降解葡萄汁中PAT的電壓與電流。

1.5 PAT降解工藝優(yōu)化

準確量取10 mL含PAT的葡萄汁于GDP反應器中，在原始工藝條件(電壓560 V、PAT初始濃度5 mg/L、處理時間3 min、不添加催化劑)的基礎上，依次改變其中1個因素，同時保持其他條件不變，即在不同的電壓、處理時間、PAT初始濃度和催化劑的條件下，以降解率為指標，進行單因素試驗。其中，電壓設置為480 V、520 V、560 V、600 V、640 V；時間設置為2 min、4 min、6 min、8 min、10 min；PAT初始濃度設置為1 mg/L、3 mg/L、5 mg/L、7 mg/L、9 mg/L；催化劑分別采用100 mg/L硫酸亞鐵、100 mg/L過氧化氫和100 mg/L抗壞血酸(ascorbic acid，AA)。降解率計算公式如式1。

(1)

式1中C0為初始PAT濃度，mg/L；Ct為降解t時間后的PAT濃度，mg/L。

在單因素試驗的基礎上，分別篩選3個水平進行L9(34)正交試驗，綜合考慮降解電壓(A)、處理時間(B)、PAT初始濃度(C)和催化劑(D)對葡萄汁中的PAT降解的影響，試驗因素水平見表1。

1.6 PAT提取及檢測

參照GB 5009.185-2016[19]并稍作修改，將GDP處理后的含PAT(初始濃度為5 mg/L)葡萄汁用20 mL蒸餾水轉(zhuǎn)移至125 mL的分液漏斗中，用30 mL乙酸乙酯提取3次，合并提取液；再加入0.2 mL冰乙酸于40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，最后用1.0 mL乙酸緩沖溶液(pH 4.0)溶解殘留物，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后進行HPLC測定。

測定方法參照GB 5009.185-2016[19]并稍作修改。色譜柱：C18反相柱(250 nm×4.6 nm×5 μm)；檢測器：紫外檢測器；波長：276 nm；流動相：乙腈∶水(1∶9，V/V)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

1.7 棒曲霉素降解動力學

為了研究GDP降解PAT的動力學過程，分別檢測經(jīng)GDP處理0 min、2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min后葡萄汁中PAT的濃度，并分別擬合零級、一級和二級動力學曲線，以分析其降解動力學特點。

1.8 葡萄汁品質(zhì)測定

準確量取10 mL含5 mg/L PAT的葡萄汁于GDP反應器中，在優(yōu)化后的最佳工藝條件下處理，隨后分別檢測葡萄汁的以下8項指標，以未經(jīng)處理的含5 mg/L PAT的葡萄汁為對照。透光率：參考吳漢東[20]分光光度法測定680 nm處透光率；濁度：利用GDS-3A光電式GDS-3A光電式渾濁度儀測定；總酸：參照GB/T 12456-2008[21]中的氫氧化鈉滴定法測定；還原性糖：采用3,5-二硝基水楊酸法測定；pH：采用PHS-3C型pH計測定；可溶性固形物(TSS)：采用阿貝折光儀測定；總酚：參照Luciano等[22]的福林酚比色法測定；總黃酮：參照Abid等[23]的硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定。

表1 GDP降解葡萄汁中PAT正交試驗方案Table 1 Orthogonal experimental scheme of patulin in grape juice degraded by GDP.

1.9 數(shù)據(jù)處理

每組試驗均進行3次重復，分別利用Excel 2010進行數(shù)據(jù)計算、Origin 9.0繪圖、SPSS 16.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 電流電壓特征曲線

以葡萄汁為電解液的GDP降解PAT的電流-電壓特征曲線如圖2所示，從中可以看出，當電壓處于0～150 V時，電流與電壓呈線性關系，電流隨電壓的變化遵循歐姆定律，在此階段發(fā)生的是水的電解；當電壓升高至150～450 V之間時，隨著電壓的增大，在兩電極的表面不斷產(chǎn)生大量的氣泡，電流呈現(xiàn)不穩(wěn)定變化，這可能是焦耳熱的作用所致；當電壓高于450 V時，電流與電壓又呈正相關性，在陽極的表面開始出現(xiàn)黃色的輝光，且輝光的強度隨著電壓的增大而變得更加劇烈。當電壓調(diào)節(jié)至560 V時，輝光放電現(xiàn)象非常明顯且比較穩(wěn)定。因此，選擇560 V電壓為降解葡萄汁中PAT的電壓，此時電流范圍為85～94 mA。

圖2 電流-電壓特征曲線Fig.2 The characteristics curve of current-voltage.

2.2 GDP對PAT的降解工藝條件

利用HPLC分別對5 mg/L PAT標準溶液、葡萄汁和含PAT(初始濃度為5 mg/L)的葡萄汁進行測定。由圖3可知，葡萄汁的基本色譜峰對PAT的測定基本無干擾，葡萄汁中的PAT也出現(xiàn)標準色譜峰(t=9.556)，經(jīng)與PAT標準溶液(t=9.561)對比重現(xiàn)性較好。因此，本研究所用方法能夠準確地定性、定量分析PAT含量的變化。

2.2.1電壓對PAT降解效果的影響 當葡萄汁中PAT初始濃度為5 mg/L時，在不同電壓下，GDP對葡萄汁中PAT處理3 min后的降解效果如圖4所示。隨著電壓的升高，GDP對PAT的降解率呈上升趨勢；電壓為480 V和520 V時，GDP對葡萄汁中PAT的降解率無顯著差異(P>0.05)；電壓升至560 V和600 V時，較520 V時，GDP對葡萄汁中PAT的降解效果分別提高了21.27%和23.78%；而當電壓繼續(xù)升高至640 V時，PAT的降解率無顯著變化(P>0.05)。

這說明，在一定反應時間內(nèi)，隨著電壓的升高，反應體系中產(chǎn)生的活性物質(zhì)(如·OH、·O、H2O2等)逐漸增多，從而使PAT的降解率得到了顯著提高。該結果與鄭繼東等[24]的研究結果一致，即隨著電壓的增加，輝光增強，PAT的降解率也逐漸增大。

2.2.2初始濃度對PAT降解效果的影響 在560 V條件下，利用GDP對含不同初始濃度PAT的葡萄汁分別處理3 min。由圖5可知，當PAT初始濃度為1 mg/L時，GDP對PAT的降解率為48.74%，顯著低于其他濃度的降解率(P<0.05)。當初始濃度為3 mg/L、5 mg/L、7 mg/L、9 mg/L時，GDP對PAT的降解率無顯著差異(P>0.05)，均在57%左右。

究其原因，在一定濃度范圍內(nèi)，不同初始濃度的PAT不影響GDP對其的降解速率。同樣的，鞏建英[25]研究的GDP對甲基橙降解作用的結果也表明，在90 min內(nèi)，GDP對不同濃度甲基橙的降解率相同。但Pu等[26]研究的GDP對不同濃度T-2毒素的降解率結果表明，在4 min內(nèi)GDP對初始濃度為38 mg/L的T-2毒素的降解率要比初始濃度為13 mg/L的T-2毒素的降解率高出6%，在相同時間內(nèi)反應物初始濃度較高時，T-2毒素的去除率較高。由此可知，只有在一定濃度范圍內(nèi)，PAT的初始濃度不影響GDP對其的降解速率；且當PAT的濃度達到一定量時，反應體系中產(chǎn)生的·OH更快的被消耗，反應向有利于PAT降解的方向進行。

圖3 棒曲霉素HPLC色譜圖Fig.3 The HPLC chromatogram of patulin.

圖4 電壓對GDP降解棒曲霉素的影響Fig.4 Effect of voltages on the degradation of patulin by GDP.

圖5 初始濃度對GDP降解棒曲霉素的影響Fig.5 Effect of initial concentrations on the degradation of patulin by GDP.

2.2.3時間對PAT降解效果的影響 在560 V條件下，利用GDP對含PAT(初始濃度為5 mg/L)的葡萄汁進行不同時間的處理。結果如圖6所示，隨著時間的增加，GDP對PAT的降解率逐漸增大，當處理時間為2 min、4 min和6 min時，GDP對PAT的降解率均具有顯著差異(P<0.05)，GDP處理10 min后，葡萄汁中PAT的降解率已達到96%，與處理6 min、8 min時的降解率均無顯著差異(P>0.05)。由于GDP處理時間和棒曲霉素初始濃度2個因素之間的相互作用對降解率的影響較大，且二者在GDP處理前5 min之內(nèi)相互作用最顯著(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，因此，本研究在后續(xù)的正交試驗中選擇1 min、3 min 和 5 min作為時間因素的3個水平。

圖6 時間對GDP降解棒曲霉素的影響Fig.6 Effect of time on the degradation of patulin by GDP.

分析其原因，隨著GDP處理時間的增加，反應體系中產(chǎn)生了更多的·OH、·O、H2O2，與PAT結合并對其造成破壞，從而使降解率增大。這與孫艷等[27]利用GDP處理蘋果汁中PAT的研究結果基本一致，本試驗研究的葡萄汁的pH約為3.35，使PAT更易被氧化。

2.2.4催化劑對棒曲霉素降解效果的影響 在560 V條件下，添加不同催化劑，利用GDP對含5 mg/L PAT的葡萄汁處理3 min。由圖7可知，添加催化劑的處理組的PAT降解率均顯著高于未添加催化劑的對照組(P<0.05)，添加硫酸亞鐵、過氧化氫和抗壞血酸組的PAT降解率比未添加催化劑的對照組分別提高了25%、34%和26%。不同催化劑對GDP的催化效果有所不同，其中以H2O2為催化劑的降解效果最佳，但3種催化劑對GDP降解PAT的催化效果之間無顯著差異(P>0.05)。

圖7 催化劑對GDP降解棒曲霉素的影響Fig.7 Effect of catalyst on the degradation of patulin by GDP.

這可能是因為，H2O2不僅加快了活性離子的產(chǎn)生速率，還通過自身的電離產(chǎn)生·OH、O2、HO2·等活性物質(zhì)，增加了反應體系活性物質(zhì)的數(shù)量，從而最大程度的提高了GDP對PAT的降解率?？箟难岷虵e2+均是通過加快反應體系中活性離子的產(chǎn)生速率，從而提高PAT的降解率。此外，F(xiàn)e2+還可與反應體系中的H2O2發(fā)生Fenton反應，加快了·OH的產(chǎn)生，使PAT的降解率得到了提高，這與Fe2+催化GDP降解的有關報道[28]結果一致。Fe2+催化歷程如下：

Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-

(1)

Fe3++H2O2→Fe2++HO2·+H+

(2)

HO2·+H2O2→H2O+O2+·OH

(3)

2.2.5正交實驗結果 從表2可知，時間因素(B)的極差R為44.3，表明時間對棒曲霉素的降解率影響最大，4種因素的主次順序是B>D>C>A，即時間、催化劑、初始濃度、電壓。4種因素對PAT的降解均有顯著影響。實驗結果表明，在A3B2C1D2工藝條件下，即電壓600 V、時間3 min、PAT初始濃度3 mg/L、催化劑為H2O2時，GDP對葡萄汁中的棒曲霉素的降解效果最佳。由于560 V與600 V對PAT降解效果無顯著差異，并基于節(jié)能及操作安全的原則，將電壓560 V、時間3 min、初始濃度3 mg/L、催化劑為H2O2作為GDP降解棒曲霉素的最佳條件。

表2 GDP降解葡萄汁中棒曲霉素正交實驗結果Table 2 Orthogonal test results of patulin in grape juice degraded by GDP.

對上述最佳條件進行驗證試驗，得到GDP對PAT的降解率為98.9%±0.05%，優(yōu)化組合條件下PAT降解率高于正交實驗中降解率最高的6號試驗條件下PAT的降解率。

2.3 棒曲霉素降解動力學特征

為了研究GDP降解葡萄汁中PAT的動力學過程，分別對經(jīng)GDP處理不同時間的葡萄汁中PAT的濃度變化進行動力學曲線擬合，結果如表3所示。Ct為GDP處理t時間后PAT的濃度，C0為GDP處理前PAT的初始濃度。

表3 GDP降解葡萄汁中PAT動力學曲線擬合結果Table 3 The kinetics curve fitteing results of patulin in grape juice by GDP.

從表3可知，在一級動力學曲線的擬合中相關系數(shù)高達0.989 0，大于零級和二級反應動力學的擬合相關系數(shù)。該結果表明輝光放電等離子體對葡萄汁中PAT的降解過程符合一級反應動力學，即GDP降解PAT的速率與PAT的濃度成正比，且該結果與相關文獻報道[26,29]結果一致。

2.4 GDP降解對葡萄汁品質(zhì)的影響

濁度、還原糖含量、總酸、總酚及總黃酮等是衡量葡萄汁品質(zhì)的重要指標。因此，通過研究在最佳工藝條件下GDP處理前后葡萄汁營養(yǎng)品質(zhì)的變化情況，分析GDP對葡萄汁品質(zhì)的影響。

在最佳工藝條件下，GDP對葡萄汁品質(zhì)的影響如表4所示。GDP處理前后葡萄汁中的還原糖和TSS均無顯著變化；表中數(shù)據(jù)顯示，GDP處理后葡萄汁的pH下降了0.05，而總酸增加了0.445 g/L，但兩者與GDP處理前相比均無顯著差異(P>0.05)。這可能是由于GDP處理后使葡萄汁中更多的有機酸溶解出來[30]，從而使總酸濃度增加、pH降低。GDP處理后葡萄汁的透光率增加了1.1%，而濁度減少了3.6%，兩者與GDP處理前相比均無顯著差異(P>0.05)，表明GDP處理可以在一定程度上提高葡萄汁的澄清度。GDP處理后葡萄汁的總酚和總黃酮均有不同程度的下降，但無顯著差異(P>0.05)，說明GDP處理不會對葡萄汁的酚類和黃酮產(chǎn)生影響。綜上所述，GDP處理可以在一定程度上提高葡萄汁的澄清度，又不會導致其總酚、總黃酮、總還原糖、總酸、TSS發(fā)生顯著變化。

表4 GDP對葡萄汁品質(zhì)的影響Table 4 The effect of GDP on the quality of grape juice.

3 討論

本研究表明，輝光放電等離子體可以有效降解葡萄汁中的棒曲霉素；GDP降解葡萄汁中PAT的最佳工藝條件為電壓560 V、時間3 min、初始濃度3 mg/L、以100 mg/L H2O2為催化劑，該條件下，GDP對PAT的降解率高達98.8%；GDP降解葡萄汁中PAT符合一級動力學特征。此外，葡萄汁理化指標評價結果表明，GDP處理對葡萄汁的還原糖、可溶性固形物、pH、總酸、總酚及總黃酮沒有顯著影響，且還可在一定程度上提高葡萄汁的澄清度。

研究輝光放電等離子體對果汁中PAT的降解效果時，為了保證葡萄汁品質(zhì)不受影響，選擇合適的處理條件至關重要。本研究結果與孫艷[31]篩選到的GDP降解蘋果汁中PAT的最佳工藝條件相比，電壓及處理時間一致，而在PAT初始濃度上存在差異，可能是反應體系媒介不同所致。另外，本研究對GDP降解葡萄汁中PAT的動力學擬合結果與Pu等[26]利用GDP降解T-2毒素符合一級降解動力學特征一致，說明GDP降解PAT的速率與PAT的濃度成正比。同時，通過比對分析GDP處理前后葡萄汁理化指標的變化情況，發(fā)現(xiàn)GDP處理對葡萄汁的還原糖、可溶性固形物、pH、總酸、總酚及總黃酮無顯著影響，且還可在一定程度上提高葡萄汁的澄清度。相比之下，常規(guī)的食品加工方法會使食品中的總黃酮、總酚等的含量顯著降低(高達46%)[32]。由此可見，GDP技術處理不僅對毒素的降解效果較好，而且不會影響葡萄汁品質(zhì)，有利于商業(yè)開發(fā)并且對消費者有益。

與傳統(tǒng)的毒素處理方法相比，GDP降解PAT具有操作簡便、快速及無二次污染等優(yōu)點，具有更高的實際應用價值。本研究已初步優(yōu)化了GDP技術對葡萄汁中棒曲霉素的降解工藝，分析了其動力學特征，同時驗證了GDP在高效降解毒素的同時，對葡萄汁品質(zhì)無影響。為GDP技術應用于果汁中毒素的降解提供了一定的理論依據(jù)，同時進一步拓寬了GDP技術的應用范圍。但關于GDP技術對PAT在果汁中的詳細降解機理及其對果汁抗氧化性等其他性質(zhì)的影響尚不清楚，將是后續(xù)深入研究的重點。