匡梅娜，黃思瑞，魯 欣，周 暢，胡耀華，唐震林，袁 茵

（1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510631）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一類組織來源廣泛的多能干細(xì)胞［1］，不僅可發(fā)生多向分化，還具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠在特定條件下抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的體內(nèi)外活化和增殖［2］，已被用于多種免疫相關(guān)疾病，如：難治性急性移植物抗宿主病的治療［3］。此外，MSC的免疫原性低［4］、易于接受外源基因修飾［5］，并具有靶向遷移到腫瘤組織、損傷組織以及慢性炎性反應(yīng)部位的特性［6］，因此可被用作腫瘤等基因治療的載體細(xì)胞。然而，在進(jìn)行體內(nèi)移植時(shí)，外源輸入的MSC在氧化應(yīng)激［7］和組織缺血、缺氧［8］等惡劣環(huán)境下會(huì)大量死亡，療效受到限制；另一方面，MSC的免疫調(diào)節(jié)能力對(duì)炎性因子的刺激有依賴性，只有在受到γ-干擾素等刺激并誘導(dǎo)性地表達(dá)吲哚胺-2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）等效應(yīng)分子后，MSC的免疫抑制活性才能表現(xiàn)出來［9］。因此，體內(nèi)存活能力低下和依賴炎性因子刺激而活化的固有屬性，是影響MSC療效及臨床適用范圍的兩個(gè)重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)，去分化（dedifferentiation）預(yù)處理能夠提高脂肪來源MSC的體內(nèi)生存率［10］，而骨髓MSC在發(fā)生成神經(jīng)去分化后也獲得了更強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激生存能力［11］。臍帶被認(rèn)為是MSC的理想來源，但目前尚無關(guān)于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hMSC）去分化特性的報(bào)道，對(duì)于去分化MSC基因修飾方面的研究亦不多見。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，IDO基因修飾可顯著增強(qiáng)hMSC的體外免疫抑制能力，且不影響其免疫表型、增殖能力和細(xì)胞活力［12］?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，我們提出通過去分化聯(lián)合IDO基因修飾的預(yù)處理手段，同時(shí)提高M(jìn)SC的抗氧化應(yīng)激能力和免疫抑制能力的研究設(shè)想，并開展了相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

臍帶取自2017年3月于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院順產(chǎn)分娩的健康足月新生兒，產(chǎn)婦無傳染性疾病。本研究已經(jīng)通過學(xué)校醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，并經(jīng)產(chǎn)婦本人知情同意。

DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰酶、青/鏈霉素溶液、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000為美國Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自浙江天杭生物科技有限公司。人淋巴細(xì)胞分離液為天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰井a(chǎn)品。共表達(dá)人IDO基因（IDO1；GenBank accession number AY221100）和ZsGreen1報(bào)告基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、ZsGreen1空載逆轉(zhuǎn)錄病毒由本室包裝構(gòu)建。質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR清潔試劑盒、膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品。PE標(biāo)記小鼠抗人CD45、PE/Cy5標(biāo)記小鼠抗人CD34、FITC標(biāo)記小鼠抗人CD4、PE/Cy5標(biāo)記小鼠抗人CD25、PE標(biāo)記小鼠抗人CD127流式抗體為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記小鼠抗人CD73、FITC標(biāo)記小鼠抗人CD90、PE標(biāo)記小鼠抗人CD105流式抗體為美國eBioscience公司產(chǎn)品。叔丁基過氧化氫（Tertbutyl hydroperoxide，t-BHP）購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。人臍帶MSC成脂和成骨誘導(dǎo)分化試劑盒購自賽業(yè)生物科技有限公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

按本室已建立方法［12-13］分離hMSC，培養(yǎng)于DMEM/F12完全培養(yǎng)基（含100 mL/L FBS、10 mL/L青/鏈霉素）中，取P2～P5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。病毒包裝細(xì)胞株P(guān)A317由本室保存，培養(yǎng)于含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基中。以上細(xì)胞均于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中貼壁生長，3～4 d傳代一次。外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）分離自健康成年人外周血，采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離。

1.3 去分化hMSC的誘導(dǎo)

將hMSC接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)100%，更換成脂分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)48 h，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，然后吸走誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入PBS洗滌細(xì)胞3次，重新加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。當(dāng)細(xì)胞重新回復(fù)為未分化時(shí)的形態(tài)時(shí)，進(jìn)行第1次傳代，即得到P0代去分化hMSC（DehMSC），之后每3～4 d換液1次，正常傳代，取P0或P1代De-hMSC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 IDO基因修飾型De-hMSC的制備

De-hMSC感染前換液，培養(yǎng)體積減半，分3組進(jìn)行感染：對(duì)照組De-hMSC正常培養(yǎng)，Mock/DehMSC組加入僅含有ZsGreen1報(bào)告基因的空載病毒（MOI=100），IDO/De-hMSC組加入共表達(dá)IDO和ZsGreen1的重組病毒（MOI=100）。接種病毒24 h后換液，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察綠色熒光蛋白報(bào)告基因ZsGreen1的胞內(nèi)表達(dá)情況，并通過Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞的IDO蛋白表達(dá)情況。

1.5 IDO基因修飾型De-hMSC的鑒定

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IDO/De-hMSC的免疫表型：消化收集細(xì)胞，制成密度為1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌1次，分裝至流式檢測(cè)管（每管100 μL），分別加入熒光標(biāo)記抗體CD73-FITC、CD90-FITC、CD105-PE、CD45-PE、CD34-PE/Cy5，并設(shè)同型對(duì)照和空白對(duì)照，室溫避光孵育30 min，洗滌2次，最后用500 μL PBS重懸細(xì)胞，上BECKMAN COULTER Gallios流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記，使用FlowJo軟件處理結(jié)果。檢測(cè)IDO/De-hMSC的成骨和成脂分化能力時(shí)，先將待測(cè)細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)至90%以上匯合，然后更換成骨或成脂分化誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次，誘導(dǎo)2～3周后，吸走誘導(dǎo)液，加入體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液固定30 min，分別加入茜素紅染色液或油紅O染色液進(jìn)行染色，鏡檢。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長期的hMSC、De-hMSC、Mock/DehMSC和IDO/De-hMSC接種至6孔板，每種細(xì)胞均按如下分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：①對(duì)照組：置DMEM/F12完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)；②t-BHP損傷組：在對(duì)照組基礎(chǔ)上加入終濃度為300 μmol/L的t-BHP作用24 h。作用結(jié)束后，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，每組取 1×105個(gè)細(xì)胞，用PBS洗滌 1次，用85 μL試劑盒中的結(jié)合緩沖液重懸，再加入10 μL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V（Annexin V-FITC）和（或）5 μL碘化丙啶（PI），輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，最后加400 μL結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞凋亡情況，使用FlowJo軟件處理結(jié)果。

1.7 Treg細(xì)胞含量測(cè)定

分別用含有不同MSC培養(yǎng)上清的條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）培養(yǎng)PBMC，之后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組PBMC中Treg細(xì)胞的含量。首先分 4組（hMSC、De-hMSC、Mock/De-hMSC、IDO/De-hMSC）收集100%匯合時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)上清，0.22 μm濾膜過濾，-80℃凍存?zhèn)溆?。用于培養(yǎng)PBMC時(shí)，取各組上清分別與DMEM/F12完全培養(yǎng)基按3∶2的體積比混合，即得到新鮮配制的條件培養(yǎng)基［14］，同時(shí)加入1 000 U/mL重組人IL-2和50 ng/mL OKT3對(duì)PBMC進(jìn)行刺激。作用5 d后離心收集各組PBMC，加入PBS洗滌1次，分裝至流式管，設(shè)空白對(duì)照、同型對(duì)照、單色熒光補(bǔ)償對(duì)照以及三色熒光標(biāo)記的待測(cè)樣本，加入對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體（CD4-FITC、CD25-PE/Cy5、CD127-PE等），室溫避光孵育30 min，洗滌2次，最后用500 μL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的含量，使用FlowJo軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 De-hMSC誘導(dǎo)過程中的細(xì)胞形態(tài)變化

加入成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)48 h后，hMSC的胞體發(fā)生明顯變化，由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形或橢圓形。撤除分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基并更換為干細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，已出現(xiàn)成脂細(xì)胞形態(tài)特征的hMSC重新恢復(fù)未分化時(shí)的細(xì)胞形態(tài)（圖1）。

2.2 De-hMSC的基因修飾及干細(xì)胞特征鑒定

圖1 De-hMSC誘導(dǎo)過程中的細(xì)胞形態(tài)圖Fig.1 Photomicrograph of cell morphology during the induction of De-hMSC

接種IDO基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒48 h后，DehMSC胞內(nèi)可見報(bào)告基因ZsGreen1大量表達(dá)（圖2A），提示細(xì)胞已被病毒成功感染。Western blot檢測(cè)顯示，IDO重組病毒感染組De-hMSC的IDO蛋白表達(dá)呈陽性（圖2B），進(jìn)一步證實(shí)De-hMSC已被IDO基因成功修飾。IDO/De-hMSC仍具有體外分化能力，經(jīng)誘導(dǎo)能夠向成骨和成脂方向分化，茜素紅染色和油紅O染色分別呈陽性（圖2C）。流式檢測(cè)結(jié)果顯示，IDO/De-hMSC表達(dá)CD90、CD73、CD105，不表達(dá)CD45和CD34（圖2D）。

圖2 IDO基因修飾型De-hMSC的鑒定Fig.2 Characterization of De-hMSC modified by IDO gene

2.3 去分化及IDO基因修飾對(duì)hMSC抗氧化應(yīng)激存活能力的影響

Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)顯示：正常培養(yǎng)時(shí)，hMSC、De-hMSC、Mock/De-hMSC及IDO/De-hMSC的細(xì)胞存活率分別為（93.5±2.7）%、（93.9±0.7）%、（92.9±2.2）%、（95.1±1.7）%；300 μmol/L t-BHP作用 24 h后，hMSC、De-hMSC、Mock/DehMSC及IDO/De-hMSC的細(xì)胞存活率分別下降至（36.0±14.2）%、（83.3±3.5）%、（79.1±4.1）%、（79.0±7.2）%；以細(xì)胞存活率（%）為應(yīng)變量，將細(xì)胞修飾方式（未修飾、去分化、去分化并轉(zhuǎn)染空載病毒、去分化并轉(zhuǎn)染IDO重組病毒）和細(xì)胞培養(yǎng)條件（正常培養(yǎng)和t-BHP處理）作為兩個(gè)因素，經(jīng)Two-Way ANOVA分析可知，細(xì)胞修飾方式分組與細(xì)胞培養(yǎng)條件分組的效應(yīng)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.57，P＜0.0001；F=96.98，P＜0.0001），且兩分組之間存在交互（F=19.74，P＜0.0001），提示細(xì)胞修飾方式及細(xì)胞培養(yǎng)條件兩個(gè)因素協(xié)同作用于細(xì)胞存活能力。進(jìn)一步采用Holm-Sidak′s分析，如圖3所示，300 μmol/L t-BHP明顯抑制hMSC存活，其細(xì)胞存活率與對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；300 μmol/L t-BHP 作用組De-hMSC、Mock/De-hMSC和IDO/De-hMSC的細(xì)胞存活率出現(xiàn)下降，但與對(duì)照組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而與300 μmol/L t-BHP作用組hMSC之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；圖3）。

2.4 IDO/De-hMSC條件培養(yǎng)基對(duì)正常人淋巴細(xì)胞Treg亞群比例的影響

三色熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組PBMC（in DMEM/F12）的CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞含量為（5.6±0.2）%，4種條件培養(yǎng)基處理組PBMC的Treg細(xì)胞含量均較對(duì)照組升高，其中IDO/De-hMSC-CM處理組的Treg細(xì)胞比例為（20.9±2.1）%，上調(diào)幅度最大，與其它各組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；hMSC-CM、De-hMSCCM、Mock/De-hMSC-CM處理組的Treg細(xì)胞含量分別為（8.7±0.5）%、（8.2±0.4）%、（7.5±0.2）%，與對(duì)照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；圖4）。

圖3 去分化和IDO基因修飾對(duì)hMSCs抗氧化應(yīng)激生存能力的影響Fig.3 The effects of dedifferentiation and IDO gene modification on the survival ability of hMSCs against oxidative stress

圖4 IDO基因修飾和去分化對(duì)hMSC誘導(dǎo)Treg細(xì)胞能力的影響Fig.4 The effect of IDO gene modification and dedifferentiation on the ability of hMSCs to induce Treg cells

3 討論

在特定誘導(dǎo)條件下，MSC可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)、心肌等多種組織細(xì)胞。不僅如此，已分化的MSC還具有重新回復(fù)為原始未分化MSC的能力，即：去分化能力。去分化又稱脫分

化，指已分化的細(xì)胞失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能，從不分裂的靜止?fàn)顟B(tài)變化到活躍的分裂狀態(tài)、重新具有原始未分化細(xì)胞特性的過程［15］。去分化也是MSC的多向分化潛能特點(diǎn)之一。在改變MSC的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件后，MSC能夠從已分化的形態(tài)回復(fù)到未分化時(shí)的原始MSC形態(tài)，并可轉(zhuǎn)分化為其它類型的細(xì)胞［16-17］。Liu等［11］發(fā)現(xiàn)，MSC源的神經(jīng)細(xì)胞在撤除神經(jīng)元誘導(dǎo)因子后發(fā)生去分化，重新回復(fù)到MSC樣狀態(tài)，與未分化的MSC相比，抗凋亡相關(guān)基因和神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)增多、生存期延長。張慧等［17］證實(shí)，MSC源的成骨細(xì)胞在撤除成骨誘導(dǎo)因子后亦可回復(fù)為MSC樣狀態(tài)，且體外再次成骨分化效率明顯高于原始MSC。本文的研究也表明，已發(fā)生成脂分化的人臍帶MSC在撤除誘導(dǎo)因素后，仍能回復(fù)到未分化時(shí)的初始形態(tài)。

體內(nèi)外的氧化應(yīng)激環(huán)境可誘導(dǎo)MSC的凋亡或大量流失，是限制MSC療效發(fā)揮的主要因素之一［7］。為模擬氧化應(yīng)激對(duì)MSC的損傷，我們建立了t-BHP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞模型，并比較了hMSC和De-hMSC在氧化應(yīng)激條件下生存能力的差異。我們發(fā)現(xiàn)，去分化預(yù)處理能夠提高h(yuǎn)MSC在氧化應(yīng)激條件下的抗凋亡能力，有望克服未分化MSC移植到體內(nèi)后存活率低下的缺點(diǎn)［8］。

IDO是MSC在受到炎性細(xì)胞因子刺激后所表達(dá)的一種重要的免疫抑制效應(yīng)分子，對(duì)MSC免疫抑制能力的發(fā)揮有直接的決定作用。但靜止?fàn)顟B(tài)的MSC并不表達(dá)IDO，只有在γ-干擾素的高強(qiáng)度刺激下，MSC才會(huì)誘導(dǎo)性地表達(dá)IDO，進(jìn)而發(fā)揮其免疫抑制作用，這一現(xiàn)象在骨髓和臍帶來源的MSC中都已得到了證實(shí)［9，18］。鑒于IDO在MSC免疫抑制效應(yīng)中的重要地位，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)De-hMSC作為載體細(xì)胞用于免疫相關(guān)疾病基因治療的能力，我們進(jìn)行了De-hMSC的IDO基因修飾和免疫調(diào)節(jié)功能研究。我們發(fā)現(xiàn)，去分化聯(lián)合IDO基因修飾，不影響hMSC的細(xì)胞形態(tài)、免疫表型及成脂、成骨分化能力；在功能上，這種經(jīng)過“雙重”改造的hMSC，不僅抗氧化應(yīng)激生存能力提高，并且對(duì)Treg細(xì)胞產(chǎn)生了一種更為顯著的接觸非依賴性誘導(dǎo)作用。

Treg細(xì)胞是機(jī)體發(fā)揮免疫抑制功能的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)細(xì)胞，在體內(nèi)的主要作用是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡，防止免疫反應(yīng)無限制擴(kuò)大及抑制自身免疫反應(yīng)的發(fā)生［19］。我們的前期研究證實(shí)，用含有hMSC培養(yǎng)上清的條件培養(yǎng)基處理PBMC，能夠上調(diào)其所含CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的含量，同時(shí)下調(diào)CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值，但對(duì)其它淋巴細(xì)胞亞群的含量無顯著影響［20］。因此，在本研究中我們重點(diǎn)分析了IDO/De-hMSC對(duì)Treg細(xì)胞的影響。我們發(fā)現(xiàn)，去分化hMSC對(duì)Treg細(xì)胞也有一定的誘導(dǎo)作用，而IDO基因修飾則使這種誘導(dǎo)作用發(fā)生了進(jìn)一步的增強(qiáng)。與本研究類似，有報(bào)道指出，過表達(dá)IDO基因的大鼠骨髓MSC對(duì)淋巴細(xì)胞中的Treg細(xì)胞有明顯的促進(jìn)作用［21］；He等［22］研究發(fā)現(xiàn)，IDO基因轉(zhuǎn)染MSC與PBMC共培養(yǎng)，可以明顯促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的增殖。已知IDO是催化色氨酸降解代謝初始步驟的限速酶，而色氨酸是效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞等維持增殖和活性的必需氨基酸，因此IDO的活性表達(dá)會(huì)對(duì)多種免疫細(xì)胞的活化、增殖產(chǎn)生直接的抑制作用。上述研究結(jié)果則提示，除了直接抑制免疫細(xì)胞的增殖外，IDO還可通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞來間接發(fā)揮免疫抑制作用。

綜上，成脂去分化聯(lián)合IDO基因修飾能夠在保留hMSC基本功能的基礎(chǔ)上，增強(qiáng)hMSC抗氧化應(yīng)激生存能力及其對(duì)Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)能力。上述研究結(jié)果加深了我們對(duì)MSC去分化以及IDO免疫抑制機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為MSC移植治療中細(xì)胞活力、免疫抑制療效等方面存在的問題提供了可借鑒的解決方案。下一步我們將利用適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型進(jìn)行IDO基因修飾型去分化MSC的體內(nèi)功能研究，以期為修飾型MSC在臨床免疫治療中的應(yīng)用提供更為全面可靠的參考。