楊 帆 王海寬 劉學勤 劉于小雪

1（鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學院，內蒙古鄂爾多斯017010）

2（天津科技大學生物工程學院，天津300457）

丁酸梭菌（Clostridium butyricum） 又稱酪酸梭狀芽胞桿菌，是人類腸道菌群的成員之一，是一種安全、有效的益生菌。丁酸梭菌最初從人類糞便和土壤中篩出，其體外發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFA），在胃腸道中具有刺激腸道蠕動，促進有益細菌生長，改善腸道微環(huán)境等作用。人源益生菌是一類來源于人體且能調節(jié)人體腸道內微生態(tài)平衡的菌群，具有很高的安全性和遺傳穩(wěn)定性，不易被生物體腸道的免疫系統(tǒng)排斥，適合作動物益生菌。本研究從健康人體糞便中篩選人源性產(chǎn)丁酸細菌，其中從一名健康女性的糞便中篩選出一株耐氧性的丁酸梭菌TK520，并對該菌進行生理特性測定。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0 g，牛心浸粉17.5 g，氯化鈉5.0g，葡萄糖2.0 g，磷酸氫二鉀2.5 g，水1000 mL，pH 7.4；強化梭菌（RCM） 培養(yǎng)基 （g/L）：蛋白胨 10.0 g，牛肉粉10.0 g，酵母粉3.0 g，葡萄糖5.0 g，可溶性淀粉1.0 g，氯化鈉5.0 g，醋酸鈉3.0 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，瓊脂0.5 g，水1 000 mL，pH 6.8；低聚葡萄糖培養(yǎng)基（g/L）：低聚葡萄糖5 g，蛋白胨10 g，K2HPO45 g，MgSO40.2 g，MnSO40.2 g，水 1 000 mL，pH7.4。

1.2 儀器設備

1200 Infinity Series紫外高效液相色譜分析儀，美國安捷倫科技有限公司（上海）；Agilent 7890A氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司（上海）。

1.3 試驗方法

1.3.1 人源性丁酸梭菌TK520的篩選方法

糞便樣品來源為天津健康人群，共5份（女性3份男性2份），年齡10～27歲，每份約10 g（采樣前2周內未服用過任何抗菌類藥物）。分別用90 mL無菌生理鹽水溶解，梯度稀釋，用RCM固體培養(yǎng)基傾注平板厭氧培養(yǎng)，反復2次挑取單菌落，接種于BHI液體培養(yǎng)基試管中厭氧培養(yǎng)，篩選出純化菌種，并對其基因組測序進行菌種鑒定。

1.3.2 丁酸梭菌TK520與標準菌株ATCC19398耐氧性的對比

取丁酸梭菌TK520和丁酸梭菌標準菌株ATCC19398甘油管，在BHI培養(yǎng)基上接種相同菌量，厭氧培養(yǎng)獲得一級種子液。試驗組：取2種丁酸菌一級種子液，相同接種量分別接入二級BHI培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝液量依次為80%、70%、60%、50%，封蓋，限氧條件培養(yǎng)24 h，獲得試驗組二級發(fā)酵液。對照組：取2種丁酸菌一級種子液，相同接種量分別接入二級BHI培養(yǎng)基中，裝液量80%，37℃厭氧培養(yǎng)獲得對照組二級發(fā)酵液。利用紫外分光光度計對獲得的二級發(fā)酵液進行菌體濃度（OD600nm） 測定。

1.3.3 α-酮異己酸的分析方法

取菌種甘油管，接種于10 mL BHI液體培養(yǎng)中厭氧培養(yǎng)，后轉接于低聚葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)，加入不同濃度的前體物L-亮氨酸母液（25 mmol/L、50 mmol/L、75 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L） 孵化 10 h、12 h、14 h、16 h、18 h后，離心取上清，過膜處理后，按紫外高效液相色譜條件進行發(fā)酵產(chǎn)物α-酮異乙酸（KIC） 分析測定。

1.3.4 丁酸梭菌TK520發(fā)酵產(chǎn)水解酶特性研究

取菌種甘油管，接種于10 mL BHI液體培養(yǎng)中厭氧培養(yǎng)，振蕩混勻，取2 mL菌液于40 mLFOS液體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)后離心，取上清液即為待測發(fā)酵樣品。按照GB/T 23527—2009中Folin試劑顯色法制備樣品，用分光光度計測定OD680nm，測定丁酸梭菌TK520發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶特性。按照GB/T 23874—2009木聚糖酶測定法制備樣品，用分光光度計測定OD540nm，測定丁酸梭菌TK520發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶特性。

2 結果與討論

2.1 菌種篩選測序結果

試驗共得到11個分離菌株，將菌株聚合酶鏈式反應（PCR） 后進行16S rDNA測序，篩選得到一株丁酸梭菌，命名為丁酸梭菌TK520。在GenBank數(shù)據(jù)庫中，可以找到丁酸梭菌TK520的基因組信息，其編號為 CP016332、CP016333和CP016334。

2.2 丁酸梭菌TK520與標準菌株ATCC19398耐氧性的對比

丁酸梭菌TK520與標準菌株ATCC19398在不同氧氣條件下所得菌液的菌體濃度見表1。

表1 兩種丁酸梭菌不同氧氣條件下所得菌液的菌體濃度

由表1可知，對照組中，2種丁酸梭菌的菌濃均在1.8以上，丁酸梭菌TK520略高于標準菌株。試驗組中，裝液量為80%時，2種丁酸菌菌濃仍保持在1.8以上，隨著裝液量的減少，限制氧的增加，標準菌株發(fā)酵液的菌濃出現(xiàn)大幅度下降，而丁酸梭菌TK520發(fā)酵液的菌濃減少幅度??；當裝液量下降至50%時，丁酸梭菌ATCC19398發(fā)酵液的菌濃僅有0.3左右。所以，丁酸梭菌TK520耐受存在限制氧的繁殖環(huán)境，較標準菌株ATCC19398有顯著的耐氧性。

2.3 丁酸梭菌TK520產(chǎn)α-酮異己酸特性分析

丁酸梭菌TK520產(chǎn)α-酮異己酸（KIC） 的情況如圖1所示。由圖1可知，當孵化時間相同時，KIC的產(chǎn)量隨著底物濃度的增加而逐漸增加；當?shù)孜餄舛认嗤瑫r，KIC的產(chǎn)量先增加后降低。當添加150 mmol/L的L-亮氨酸37℃孵化16 h時，丁酸梭菌TK520產(chǎn)KIC最高，為（6.23±0.75） mg/L。

圖1 丁酸梭菌TK520產(chǎn)KIC（±SD，n=3）

2.4 丁酸梭菌TK520發(fā)酵液酶活分析

2.4.1 丁酸梭菌TK520產(chǎn)蛋白酶特性分析

丁酸梭菌TK520發(fā)酵時產(chǎn)生的蛋白酶酶活力測定結果見圖2。

圖2 利用7種低聚糖測定蛋白酶酶活力（±SD，n=3）

由圖2可知，丁酸梭菌TK520利用低聚果糖（FOS） 發(fā)酵時，發(fā)酵液中蛋白酶酶活力最高，為（50.74±1.82） U/mL，說明丁酸梭菌TK520作為動物飼用添加劑可以在動物腸道內協(xié)助分解蛋白類成分，促進動物消化。

2.4.2 丁酸梭菌TK520產(chǎn)木聚糖酶特性分析

圖3 利用7種低聚糖測定木聚糖酶活力（±SD，n=3）

由圖3可知，丁酸梭菌TK520利用低聚木糖（XOS）發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的酶活力最高，為（2.5±0.04） U/mL。

3 結論

本試驗篩選出的丁酸梭菌TK520包含耐氧編碼基因，與標準菌株相比耐氧性顯著。當添加150 mmol/LL-亮氨酸37℃孵化16 h時，其KIC產(chǎn)量最高，為（6.23±0.75） mg/L；利用FOS發(fā)酵時，丁酸梭菌TK520發(fā)酵液中蛋白酶酶活力最高，為（50.74±1.82） U/mL；利用XOS發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的酶活力最高，為（2.5±0.04） U/mL。