吳海波，江連洲

(1.北部灣大學(xué) 食品工程學(xué)院，廣西 欽州 535011； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

大豆是我國(guó)傳統(tǒng)糧油作物，不僅含20%～30%油脂，還含有30%～40%蛋白質(zhì)，因此也是重要的植物蛋白資源[1]。大豆蛋白不僅營(yíng)養(yǎng)效價(jià)高，而且功能特性良好[2]，被廣泛應(yīng)用于肉類(lèi)[3]、飲料[4]、冷飲[5]及保健食品[6]中。工業(yè)制取大豆油目前主要有壓榨法和溶劑浸出法。壓榨法制油所得油品質(zhì)好，但出油率低，動(dòng)力消耗大，生產(chǎn)成本高；溶劑浸出法出油率高，但溶劑易殘留且回收工藝煩瑣，生產(chǎn)安全性差，環(huán)境污染大[7]。水酶法制取大豆油是一項(xiàng)環(huán)境友好制油技術(shù)，由于具有油品質(zhì)好、環(huán)境污染小、能源消耗低、無(wú)溶劑殘留、生產(chǎn)安全性高、同時(shí)獲得油脂和蛋白質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)[8]，受到廣泛關(guān)注。其原理是在機(jī)械破碎的基礎(chǔ)上采用破壞植物細(xì)胞壁、脂蛋白或脂多糖的酶水解豆粉，使油脂從蛋白質(zhì)、多糖或細(xì)胞壁的束縛中釋放出來(lái)，再利用油水密度差離心得到游離油、含油的乳狀液、水解液及豆粉殘?jiān)?部分，然后分別回收乳狀液中的油和溶解于水解液中的蛋白，從而實(shí)現(xiàn)油脂和蛋白質(zhì)的提取[9]。與其他酶比較，蛋白酶水相提取能獲得更高的油脂得率[10]，因此是目前水酶法提油工藝的常用酶。

許多學(xué)者在提高總油得率[11]、破乳方法[12]、擴(kuò)大中試[13]等方面對(duì)水酶法提油工藝進(jìn)行深入研究，并取得良好效果。但目前缺乏對(duì)水酶法提油期間蛋白酶解狀態(tài)的系統(tǒng)研究，蛋白酶解狀態(tài)不僅與油脂釋放程度緊密相關(guān)[7]，而且反映了水酶法提油工藝的過(guò)程及機(jī)理，特別是酶解期間蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的變化直接決定所得蛋白的性質(zhì)和應(yīng)用[14]，在提高總油得率的同時(shí)，明確所得蛋白相對(duì)分子質(zhì)量，有益于將來(lái)蛋白功能特性的研究，有利于水酶法提油技術(shù)經(jīng)濟(jì)效益的提高。

本文在前期粗酶提取大豆油取得良好實(shí)驗(yàn)效果基礎(chǔ)上[1]，結(jié)合不同酶解時(shí)期(1、2、4、6 h)油和蛋白得率，考察蛋白相對(duì)分子質(zhì)量變化，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)酶解期間豆粉、水解液、乳狀液超微結(jié)構(gòu)，從影像角度直觀觀察油、蛋白在豆粉、水解液、乳狀液中的分布變化，闡明粗酶提油過(guò)程中蛋白酶解狀態(tài)以及油脂釋放情況，并為所得蛋白性質(zhì)及應(yīng)用的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

大豆，墾農(nóng)22號(hào)，貯存于4℃冰箱中。

牛血清白蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量66 000 Da)、卵白蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量44 000 Da)、胰蛋白酶(相對(duì)分子質(zhì)量21 000 Da)、溶菌酶(相對(duì)分子質(zhì)量14 000 Da)和胰島素(相對(duì)分子質(zhì)量5 500 Da)標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥96%，Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)、蘇丹紅Ⅲ、磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、乙醇等，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BH-2研究級(jí)顯微鏡，日本OLMAPS公司；S-3400N掃描電子顯微鏡，日本日立公司；AKTApurifier100蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，瑞典安砝碼尼亞公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豆粉的擠壓膨化[15]

將大豆粉碎后調(diào)節(jié)水分含量至14%，在擠壓膨化機(jī)套筒溫度90℃、螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min、模孔孔徑18 mm條件下進(jìn)行擠壓膨化，所得膨化物料粉碎并過(guò)100目篩，貯存于4℃冰箱中備用。經(jīng)測(cè)定，膨化豆粉中油脂含量22.1%，蛋白質(zhì)含量32.3%。

1.2.2 粗酶提取大豆油過(guò)程中豆粉殘?jiān)⑷闋钜骸⑺庖旱氖占?/p>

采用前期的研究成果[1]，利用富含堿性蛋白酶和中性蛋白酶的粗酶液進(jìn)行大豆油的提取，并收集不同酶解時(shí)期的豆粉殘?jiān)?、乳狀液、水解液。具體工藝為：在粗酶液中堿性蛋白酶酶活(2 000±200)U/mL、中性蛋白酶酶活(1 500±200)U/mL時(shí)，加入磷酸一氫鈉和磷酸二氫鈉配制成0.2 mol/L的緩沖酶液，將膨化豆粉倒入緩沖酶液中，使大豆粉質(zhì)量與酶液體積比為1∶8，在55℃、起始pH 10時(shí)分別酶解1、2、4、6、8 h，然后90℃加熱10 min滅酶，4 500 r/min離心20 min，離心管中出現(xiàn)豆粉殘?jiān)?、水解液、乳狀液、游離油4層物質(zhì)，將豆粉殘?jiān)⑺庖?、乳狀液分別從離心管中分離出來(lái)，備用。

1.2.3 水相提取大豆油工藝中水解液的制備

未加酶的水相提取大豆油工藝水解液制備參照文獻(xiàn)[16]，具體工藝為：在膨化豆粉中加入蒸餾水，使料液比達(dá)1∶10，水浴加熱至料液溫度50℃時(shí)，將pH調(diào)節(jié)至7并保持恒定持續(xù)攪拌1 h，然后將料液pH調(diào)至8，繼續(xù)攪拌15 min后，4 500 r/min離心20 min，取中間水解液，備用。

1.2.4 酶解過(guò)程中油脂釋放和蛋白提取率的測(cè)定

將1.2.2所得不同酶解時(shí)期的豆粉殘?jiān)湃腚姛岷銣馗稍锵渲?0℃烘干至質(zhì)量恒定，豆粉殘?jiān)械挠椭恳罁?jù)GB 5009.6—2016中索氏抽提法測(cè)定，蛋白質(zhì)含量依據(jù)GB 5009.5—2016中凱氏定氮法測(cè)定。酶解過(guò)程中油脂釋放和蛋白提取情況分別用總油提取率和總蛋白提取率表達(dá)，具體按以下公式計(jì)算。

總油提取率=(膨化豆粉質(zhì)量×油脂含量-酶解后豆粉殘?jiān)杏椭|(zhì)量)/(膨化豆粉質(zhì)量×油脂含量)×100%

總蛋白提取率=(膨化豆粉質(zhì)量×蛋白質(zhì)含量-酶解后豆粉殘?jiān)械鞍踪|(zhì)質(zhì)量)/(膨化豆粉質(zhì)量×蛋白質(zhì)含量)×100%

1.2.5 酶解過(guò)程中蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的變化

將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白、卵白蛋白、胰蛋白酶、溶菌酶和胰島素分別稱(chēng)取10 mg溶解于3 mL pH 7.2的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖溶液中，并振蕩混合均勻，采用蛋白質(zhì)純化儀(選用SephadexG-75凝膠層析柱)進(jìn)行洗脫，上樣量1 mL，280 nm紫外吸收波長(zhǎng)下檢測(cè)各標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間和吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量(M)對(duì)數(shù)(logM，y)為縱坐標(biāo)，出峰時(shí)間(x)為橫坐標(biāo)作線性圖。

將水相提取大豆油所得水解液與粗酶提油不同酶解時(shí)期(1、2、4、6、8 h)水解液分別透析脫鹽后噴霧干燥制成干粉，按上述條件進(jìn)行溶解，樣品經(jīng)0.45 μm的濾膜過(guò)濾。在上樣量0.5 mL、樣品流速0.5 mL/min、紫外波長(zhǎng)280 nm下檢測(cè)流出層析柱樣品的吸光值及出峰時(shí)間。

1.2.6 酶解過(guò)程中豆粉超微結(jié)構(gòu)變化分析

將酶解1、2、4、6 h的豆粉殘?jiān)謩e用2.5%戊二醛混合液固定，磷酸緩沖液漂洗后，經(jīng)50%、70%、90%和100%乙醇梯度脫水，用醋酸異戊酯置換乙醇后，再用臨界點(diǎn)干燥法進(jìn)行干燥，經(jīng)離子濺射噴金，置于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.2.7 酶解過(guò)程中水解液微觀結(jié)構(gòu)變化測(cè)定

利用考馬斯亮藍(lán)對(duì)蛋白質(zhì)染色，蘇丹紅Ⅲ對(duì)脂肪球染色的原理，將酶解1、2、4、6 h的豆粉水解液分別滴于載玻片上，并添加考馬斯亮藍(lán)、蘇丹紅Ⅲ混勻染色，覆蓋玻片后置于研究級(jí)顯微鏡下觀察。所有照片均為放大100倍后的影像。

1.2.8 酶解過(guò)程中乳狀液微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定

將不同酶解時(shí)期的乳狀液按1.2.7方法進(jìn)行染色，并分別置于研究級(jí)顯微鏡下觀察。所有照片均為放大100倍后的影像。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次，采用Statistix8.1軟件對(duì)1.2.4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較數(shù)值間差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解過(guò)程中油脂釋放和蛋白提取率的變化(見(jiàn)圖1)

圖1 不同酶解時(shí)期的總油和總蛋白提取率

由圖1可知，酶解1 h時(shí)，總油和總蛋白提取率都較低，隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，總油和總蛋白提取率相應(yīng)提升，酶解6 h時(shí)總油和總蛋白提取率達(dá)到最高，分別為94.2%和90.1%，此后隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，油和蛋白提取率均變化不明顯。由于包裹在油脂外圍的蛋白不斷被酶解，有效促進(jìn)了油脂釋放，導(dǎo)致總油提取率隨蛋白提取率的增加而增加。

2.2 粗酶提取大豆油過(guò)程中蛋白相對(duì)分子質(zhì)量變化

按1.2.5方法得到的5種混合蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的凝膠洗脫圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的凝膠洗脫圖譜

由圖2可知，牛血清白蛋白、卵白蛋白、胰蛋白酶、溶菌酶、胰島素標(biāo)準(zhǔn)品分別在10.03、11.12、12.97、14.63、16.35 min時(shí)出峰。通過(guò)對(duì)各蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間(x)與相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)(logM，y)進(jìn)行線性擬合，得出各標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)與出峰時(shí)間呈線性關(guān)系，線性方程為y=-0.164 6x+6.478 5(R2=0.987)。

圖3為酶解過(guò)程中水解液中蛋白的凝膠洗脫圖譜，將各峰對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間代入線性方程，計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量及其分布，并進(jìn)一步由洗脫圖譜中各峰面積計(jì)算各組分含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

注：每個(gè)樣品均重復(fù)3次，重復(fù)測(cè)定的差異不超過(guò)1%。

由圖3可知，酶解1 h的水解蛋白洗脫圖中7.39 min處有一較高的洗脫峰(圖3a)，結(jié)合圖2可知，這是相對(duì)分子質(zhì)量在66 000 Da以上的蛋白組分，此時(shí)蛋白中相對(duì)分子質(zhì)量小于5 500 Da的短肽含量最低，而相對(duì)分子質(zhì)量大于33 000 Da的多肽含量最高(圖4)。酶解2 h時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量66 000 Da 以上的蛋白組分盡管仍然存在(圖3b)，但含量減少，而相對(duì)分子質(zhì)量10 000～33 000 Da的中肽含量明顯增加(圖4)，在所有組分中比例最高；此后隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，7.39 min附近的蛋白洗脫峰消失(圖3c)，中肽(相對(duì)分子質(zhì)量10 000～33 000 Da)含量也逐漸降低，而相對(duì)分子質(zhì)量小于5 500 Da的小肽含量明顯上升(圖4)；酶解6 h時(shí)，大分子肽及中肽含量繼續(xù)降低，小肽(<5 500 Da)含量進(jìn)一步上升(圖3d、圖4)，達(dá)49.63%，成為蛋白中的主要成分；此后隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白中各組分含量不再變化，達(dá)到酶解終點(diǎn)(圖3e、圖4)。

水相提取大豆油工藝所得蛋白中相對(duì)分子質(zhì)量大于33 000 Da的多肽含量最高，占65.63%，其中還含有部分相對(duì)分子質(zhì)量大于66 000 Da的多肽，而相對(duì)分子質(zhì)量小于5 500 Da的短肽含量極低，僅占14.42%(圖3f、圖4)。粗酶提取大豆油工藝由于酶解作用，伴隨蛋白酶解程度加深，相對(duì)分子質(zhì)量較大的多肽及中肽逐漸被水解生成相對(duì)分子質(zhì)量較小的短肽，最終所得蛋白是以相對(duì)分子質(zhì)量小于5 500 Da短肽為主(49.63%)，中肽(10 000～33 000 Da)占29.22%，相對(duì)分子質(zhì)量大于33 000 Da的多肽占21.15%的混合物，特別是相對(duì)分子質(zhì)量大于66 000 Da的多肽已不存在。研究證實(shí)蛋白酶解物由于較小的相對(duì)分子質(zhì)量從而使其具有比酶解前更好的溶解分散性[17]和消化吸收性[18]，因此常被應(yīng)用于酸性飲料以提高蛋白含量，用于發(fā)酵培養(yǎng)基中，可促進(jìn)菌種生長(zhǎng)、縮短發(fā)酵時(shí)間[19]。特別是短肽具有良好的生物活性，諸如抑制腫瘤生長(zhǎng)[20]、抗氧化[21]、抗疲勞[22]等功能，從而被制成功能性食品。粗酶提取所得蛋白各組分可進(jìn)一步進(jìn)行分離純化和性能測(cè)試，以明確所具有的功能特性。

本實(shí)驗(yàn)6 h為粗酶酶解豆粉終點(diǎn)，此時(shí)總蛋白和總油提取率最高。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)只觀察酶解1～6 h的豆粉、水解液、乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)。

2.3 酶解過(guò)程中豆粉的超微結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖5)

圖5 酶解前和粗酶水相提取大豆油過(guò)程中 豆粉的超微結(jié)構(gòu)電鏡圖

由圖5可知：未膨化豆粉中細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞壁完整，蛋白與油脂體被完整包裹在細(xì)胞中(圖5a)；經(jīng)擠壓膨化后豆粉中連接各細(xì)胞的間隙物質(zhì)被破壞，細(xì)胞排列松散，而且擠壓膨化造成細(xì)胞壁破裂(圖5b)，這為水進(jìn)入細(xì)胞取代油以及酶的入侵提供了便利[11]；酶解1 h時(shí)，豆粉細(xì)胞內(nèi)的蛋白僅部分被酶解，大部分蛋白結(jié)合體未被酶解，因此即使在低倍數(shù)掃描電鏡下仍可清晰看到細(xì)胞內(nèi)殘留著較完整的細(xì)胞質(zhì)(圖5c)；伴隨酶解進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)逐漸減少(圖5d)，酶解4 h時(shí)，豆粉細(xì)胞內(nèi)大部分蛋白被酶解，在高分辨率鏡頭下也僅觀察到只有較少的蛋白體殘留在細(xì)胞內(nèi)(圖5e)；酶解6 h時(shí)，豆粉細(xì)胞內(nèi)的蛋白體幾乎全部被酶解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)也被進(jìn)一步破壞(圖5f)。

圖5清晰展示了充滿(mǎn)油脂和蛋白等物質(zhì)的完整豆粉細(xì)胞由于酶解導(dǎo)致僅剩細(xì)胞壁的過(guò)程，伴隨豆粉細(xì)胞中蛋白體的解離，總油和總蛋白提取率逐漸增加，這進(jìn)一步證明蛋白酶在水相提取大豆油工藝中的有效性。

2.4 酶解期間水解液中油與蛋白的狀態(tài)

為進(jìn)一步揭示粗酶提油過(guò)程中蛋白酶解和油脂釋放狀態(tài)，采用特異性染色方法對(duì)酶解過(guò)程中的水解液進(jìn)行染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6a可知，酶解1 h時(shí)水解液中染藍(lán)的面積及桔紅色的油滴都較少，即使在放大100倍的光鏡圖中油滴粒徑也較小。伴隨酶解的進(jìn)行，水解液光鏡圖中藍(lán)色區(qū)域逐漸增大，意味水解液中蛋白含量增加；酶解4 h時(shí)，水解液幾乎全被染成藍(lán)色，油滴含量明顯增多且粒徑變大；酶解6 h時(shí)，水解液呈現(xiàn)更均勻的藍(lán)色，油滴數(shù)量減少，但粒徑大的油滴數(shù)量增多。

酶解1 h時(shí)，豆粉中僅有少量的蛋白被酶解，導(dǎo)致釋放的油較少，因此殘留在豆粉中的油脂和蛋白較多，而分布在水解液中的蛋白和油脂含量較低。隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白酶解程度加深，釋放的油脂逐漸增多，特別是在酶解6 h時(shí)豆粉中的蛋白和油脂得到了極大的解離和釋放，導(dǎo)致溶解在水解液中的蛋白和油脂含量增加，油滴粒徑增大，此時(shí)蛋白得率最高，而且水解液中蛋白相對(duì)分子質(zhì)量較低，導(dǎo)致蛋白溶解分散性能提升[17]，因此水解液光鏡圖顯示為較均勻的藍(lán)色。

從圖6可知水解液中溶有較多的油脂，這部分油脂占水酶法提油工藝總油提取率的10%～20%[7]，造成水酶法實(shí)際得油率低于總油提取率。因此，如何減少或者回收溶解在水解液中的油脂，是提高水酶法提油工藝經(jīng)濟(jì)效益，早日實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的另一重要科研課題。

2.5 酶解期間乳狀液中油與蛋白的狀態(tài)

由于蛋白具有良好的乳化性[9]，因而在水酶法提油工藝中，釋放的油脂被同時(shí)酶解的蛋白乳化，導(dǎo)致提取的油大部分以乳狀液的形式存在[12]。圖7為酶解過(guò)程中乳狀液結(jié)構(gòu)光鏡圖。

由圖7可知，隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，乳狀液中油滴數(shù)量增多且粒徑不斷增大。特別是酶解6 h時(shí)，乳狀液中的油滴粒徑大且較均勻。這與水解液中油滴數(shù)量和粒徑變化趨勢(shì)一致。值得注意的是，乳狀液中各油滴被由考馬斯亮蘭染成藍(lán)色的蛋白膜所包裹，從而使各油滴彼此分離。

酶解剛進(jìn)行時(shí)，僅有少部分蛋白被解離，造成油脂釋放量低，這不僅體現(xiàn)在水解液中油滴數(shù)量少，也體現(xiàn)在乳狀液中油滴含量低。隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，油脂釋放量逐漸增長(zhǎng)，導(dǎo)致聚集在乳狀液中的油滴數(shù)量增加。一方面乳狀液中的油滴由于自身聚合作用導(dǎo)致油滴粒徑逐漸增大[9]，另一方面水相中的蛋白酶除能降解豆粉細(xì)胞以及水解液中的蛋白外，還可破壞乳狀液中包裹在油滴表面的蛋白膜[23]，從而釋放油滴，促進(jìn)油滴聚合，導(dǎo)致油滴隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)粒徑增大。

3 結(jié) 論

粗酶水相提取大豆油過(guò)程中，隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白提取率及油脂釋放量上升，酶解1 h所得蛋白中相對(duì)分子質(zhì)量大于33 000 Da的多肽含量最高，相對(duì)分子質(zhì)量小于5 500 Da的短肽含量較低。隨酶解進(jìn)行，蛋白酶解程度加深，相對(duì)分子質(zhì)量大的多肽含量逐漸降低，相對(duì)分子質(zhì)量小的短肽含量上升，6 h時(shí)達(dá)到酶解終點(diǎn)，此時(shí)總油和總蛋白提取率最高，分別為94.2%和90.1%，所得蛋白是以相對(duì)分子質(zhì)量小于5 500 Da的短肽(占49.63%)為主，中肽(10 000～33 000 Da)含量29.22%，相對(duì)分子質(zhì)量大于33 000 Da的多肽含量較低(占21.15%)的混合物，這為所得蛋白的性能與應(yīng)用提供了理論參考。

掃描電鏡和光鏡圖顯示伴隨酶解進(jìn)行，豆粉內(nèi)蛋白和油脂逐漸被分解和釋放，導(dǎo)致水解液中蛋白和油脂含量相應(yīng)增加，而乳狀液中油滴不僅數(shù)量增加且粒徑增大。