孔維寶，陳 冬，楊 洋，楊樹玲，張愛梅，牛世全

(1.西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070； 2.金徽酒股份有限公司，甘肅 隴南 742308)

豆渣是豆制品加工過程中的主要副產(chǎn)物，我國作為大豆生產(chǎn)大國、進(jìn)口大國和消費大國，據(jù)測算每年產(chǎn)生2 000多萬t的濕豆渣，產(chǎn)量大、來源廣[1]。豆渣營養(yǎng)豐富，富含膳食纖維、蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵、維生素等多種營養(yǎng)成分，是目前動物日糧中最常用的蛋白飼料，但高纖維含量以及多種抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在，導(dǎo)致豆渣不易被機(jī)體降解消化，使其利用率降低，且在加工過程中產(chǎn)生的豆腥味無法去除，最終導(dǎo)致豆渣的開發(fā)利用效果不佳[2-3]。研究表明，微生物發(fā)酵豆渣不僅能有效緩解這些不利因素，還可進(jìn)一步提高其營養(yǎng)價值，是豆渣高效利用的有效途徑之一[4]。

紅曲霉(Monascus)為一種小型絲狀腐生真菌，其代謝過程中可產(chǎn)生紅曲色素、Monacolin類膽固醇合成抑制劑、抑菌性物質(zhì)等多種生理活性物質(zhì)，尤其是紅曲色素被視為安全性極高的天然食用色素，還可預(yù)防多種疾病，有望替代化學(xué)合成色素，在食品領(lǐng)域廣泛使用[5-6]。以紅曲霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵是獲取其代謝產(chǎn)物的主要途徑之一，目前固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)紅曲色素主要以大米為原料進(jìn)行發(fā)酵，但以大米為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)生產(chǎn)紅曲色素的成本較高，在工業(yè)上很難實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)[7]。因此，從綠色環(huán)保和有效開發(fā)利用農(nóng)業(yè)廢棄物的角度出發(fā)，將豆渣、豆粕、玉米、麥麩等一些廉價的農(nóng)產(chǎn)品及其加工廢棄物用作固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，用來發(fā)酵生產(chǎn)紅曲霉次級代謝產(chǎn)物及微生物飼料的研究具有重要的實際應(yīng)用價值。已有的研究表明紅曲霉可利用多種農(nóng)林廢棄物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生物活性物質(zhì)[8]?；诖?，本文主要探討了以紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)固態(tài)發(fā)酵豆渣產(chǎn)紅曲色素的可行性，對以豆渣為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)紅曲色素的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期篩選出廉價高效的有機(jī)固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)和工藝參數(shù)，為紅曲霉固態(tài)發(fā)酵制劑(營養(yǎng)強(qiáng)化劑或功能飼料)的開發(fā)提供實驗依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種與試劑

紫色紅曲霉(M.purpureus)菌株由作者所在實驗室從市售紅曲米中分離、鑒定并保藏。

無水乙醇、硫酸鎂、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、甘油，均為分析純；紅曲紅標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9080B改良恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上?，槴\實驗設(shè)備公司)，GI54TW高壓蒸汽滅菌鍋(致微儀器有限公司)，AC2-4S1生物安全柜(新加坡藝思高)，CP124C分析電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司)，TG20-WS離心機(jī)(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司)，F(xiàn)CD-3000恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海瑯玕實驗設(shè)備公司)，UV-2800紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種保藏培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，自然pH。

固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)：分別以干燥的豆渣(大豆制品加工廢棄物)、大米、大豆粉、去皮大豆粉和小麥麩皮為發(fā)酵基質(zhì)，各稱取20 g后加一定量的蒸餾水混勻調(diào)節(jié)初始含水量，121℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵種子液的制備

取4℃冰箱保存的M.purpureus接種于PDA斜面培養(yǎng)基，30℃活化培養(yǎng)5～7 d，向活化后的PDA斜面培養(yǎng)基中加入5 mL無菌水，輕輕刮下孢子，制成孢子懸浮液。吸取2 mL孢子懸浮液接種于含有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于200 r/min、30℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

向固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入一定量發(fā)酵種子液，控制溫度30℃、濕度60%～65%的條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.3 紅曲色素的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精密稱取10 mg紅曲紅標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙醇溶解定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL紅曲紅溶液。精密吸取1、2、3、4、5、6 mL至10 mL容量瓶中，70%乙醇定容至刻度，得到10、20、30、40、50、60 μg/mL的紅曲紅標(biāo)準(zhǔn)溶液。70%乙醇作空白，分別測定各質(zhì)量濃度溶液在505 nm處的吸光值，并以質(zhì)量濃度(y)為縱坐標(biāo)，505 nm處的吸光值(A)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=0.097A+0.002 1，R2=0.998 53。

紅曲色素測定：將發(fā)酵后的固態(tài)基質(zhì)冷凍干燥后粉碎，稱取1.00 g樣品加入10 mL 70%乙醇，60℃水浴提取2 h后，3 000 r/min離心10 min，取上清液；沉淀物在相同條件下重復(fù)提取2次，合并上清液，定容、稀釋后測定505 nm處的吸光值。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算紅曲色素含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Origin 9進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，SPSS 22和Latin.lnk正交設(shè)計助手用于數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)對M. purpureus產(chǎn)紅曲色素的影響

不同固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)大米、去皮大豆粉、大豆粉、豆渣和小麥麩皮分別加入10、15、20 mL水調(diào)整基質(zhì)初始含水量分別為33.33%、42.86%、50%，按10%的接種量接入發(fā)酵種子液，按1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)14 d后，測定發(fā)酵固體樣品中的紅曲色素含量，探究不同固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)對M.purpureus產(chǎn)紅曲色素的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)對紅曲色素含量的影響

由圖1可知，固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)初始含水量低，不利于紅曲色素的產(chǎn)生，整體來看，在基質(zhì)初始含水量50%的條件下產(chǎn)紅曲色素的效果相對較好。原因在于固態(tài)發(fā)酵中幾乎沒有游離水，微生物生長所需水分主要依賴于基質(zhì)初始含水量，較低的基質(zhì)初始含水量加上后期的蒸發(fā)，導(dǎo)致基質(zhì)較干，不足以滿足微生物大量生長繁殖對水分的需求，從而抑制了紫色紅曲霉的生長[9]。整體來看，大米和豆渣發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)紅曲色素的效果最好，且兩者差距不大，遠(yuǎn)高于去皮大豆粉、大豆粉和小麥麩皮產(chǎn)紅曲色素的量。由于大米主要成分為淀粉，被紅曲淀粉酶降解為葡萄糖加以利用，為紫色紅曲霉的生長提供了豐富的碳源，此外大米發(fā)酵基質(zhì)保濕效果也相對較好，利于色素的積累[10-11]。而大豆的蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維含量較高，為紫色紅曲霉的生長提供了豐富的碳、氮源。豆渣是大豆經(jīng)物理壓榨或高溫處理得來的，加工過程中更容易使一些不溶性膳食纖維大分子轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿拥途垠w的膳食纖維降解物，被微生物利用，同時豆渣顆粒度大于大豆粉，不易粘連成塊，增加了CO2和O2的通透性，不僅促進(jìn)了紫色紅曲霉生長，還增加了紅曲色素的積累[12]。通過比較去皮大豆粉和大豆粉的紅曲色素的量可以推測，大豆皮中可能存在某種物質(zhì)能夠促進(jìn)紫色紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素，也可能由于大豆皮的存在增大了發(fā)酵基質(zhì)間的孔隙，增加了通氣性。基于發(fā)酵基質(zhì)廉價且能高產(chǎn)紅曲色素的目標(biāo)，本文選取豆渣做進(jìn)一步的優(yōu)化實驗。

2.2 不同營養(yǎng)因子對M.purpureus固態(tài)發(fā)酵豆渣產(chǎn)紅曲色素影響的單因素實驗

2.2.1 甘油添加量的影響

甘油作為能被紅曲霉快速利用的常用碳源之一，不僅價格低廉容易獲得，還可使菌體生長過程完成后仍保持碳代謝的饑餓狀態(tài)，促進(jìn)紅曲色素的大量積累[13-14]。以豆渣為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，在接種量10%、豆渣加水量15 mL的條件下，按1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)14 d，考察不同甘油添加量(1%、3%、5%、7%、9%)對M.purpureus產(chǎn)紅曲色素的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 甘油添加量對紅曲色素含量的影響

由圖2可知，甘油添加量在1%～5%時，紅曲色素含量呈現(xiàn)急速上升趨勢，甘油添加量為5%～7%時，紅曲色素含量緩慢上升，當(dāng)甘油添加量在7%～9%時，紅曲色素含量出現(xiàn)下降趨勢，且甘油添加量為7%時紅曲色素含量達(dá)到最大值。該現(xiàn)象可能是由于低濃度的甘油作為碳源促進(jìn)了紫色紅曲霉生物量的積累，逐漸提高紅曲色素含量。當(dāng)甘油添加量大于7%時，碳源積累過多降低了發(fā)酵底物的pH，抑制產(chǎn)物積累[15]。

2.2.2 NaNO3添加量的影響

NaNO3是促進(jìn)紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的最佳氮源之一。以豆渣為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，在豆渣加水量15 mL、接種量10%條件下，按1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)14 d，考察不同NaNO3添加量(0.01%、0.04%、0.07%、0.10%、0.13%、0.16%)對M.purpureus發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 NaNO3添加量對紅曲色素含量的影響

由圖3可知，NaNO3添加量在0.01%～0.04%時，紅曲色素含量呈現(xiàn)上升的趨勢，NaNO3添加量在0.04%～0.16%時，紅曲色素含量逐漸降低，且豆渣中NaNO3添加量為0.04%時紅曲色素含量達(dá)到最大值。NaNO3為紫色紅曲霉的生長繁殖提供氮源，在低濃度NaNO3的添加范圍內(nèi)，氮源被紫色紅曲霉充分利用，增加生物量的同時提升了紅曲色素含量。當(dāng)NaNO3添加量達(dá)到飽和后，不再被紫色紅曲霉利用，此時高濃度的NaNO3抑制了紫色紅曲霉的生長代謝[16]。

2.2.3 KH2PO4添加量的影響

以豆渣為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，在豆渣加水量15 mL、接種量10%條件下，按1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)14 d，考察不同KH2PO4添加量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)對M.purpureus發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 KH2PO4添加量對紅曲色素含量的影響

由圖4可知，KH2PO4添加量在0.1%～0.2%內(nèi)，紅曲色素含量緩慢上升，在0.2%～0.4%的范圍內(nèi)，紅曲色素含量迅速增加，KH2PO4添加量在0.4%～0.5%時，紅曲色素含量呈現(xiàn)下降趨勢，且KH2PO4添加量為0.4%時紅曲色素含量達(dá)到最大值。無機(jī)鹽濃度可以顯著影響菌體細(xì)胞的生長和紅曲色素的形成，因此低濃度的無機(jī)鹽有益于紫色紅曲霉的生理活動，而當(dāng)濃度過高時主要表現(xiàn)為抑制等負(fù)面效應(yīng)，該結(jié)果與周建建等[17]結(jié)果趨勢相似。

2.2.4 MgSO4添加量的影響

以豆渣為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，在豆渣加水量15 mL、接種量10%條件下，按1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)14 d，考察不同的MgSO4添加量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)對M.purpureus發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 MgSO4添加量對紅曲色素含量的影響

由圖5可知，MgSO4添加量在0.1%～0.2%內(nèi)，紅曲色素含量逐漸上升，在0.2%～0.4%的范圍內(nèi)，紅曲色素含量急速下降，在0.4%～0.5%時，紅曲色素含量呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，MgSO4添加量為0.2%時紅曲色素含量達(dá)到最大值，此時MgSO4促進(jìn)了紫色紅曲霉的生理活動和紅曲色素的產(chǎn)生，當(dāng)添加量大于0.2%時，濃度過高則抑制了紫色紅曲霉的生長。

2.2.5 抗壞血酸添加量的影響

抗壞血酸能夠在一定程度上提高紅曲色素的穩(wěn)定性，同時還能促進(jìn)紅曲霉的生長和色素的產(chǎn)生[18]。以豆渣為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，在豆渣加水量15 mL、接種量10%條件下，按1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)14 d，考察不同的抗壞血酸添加量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)對M.purpureus產(chǎn)紅曲色素的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 抗壞血酸添加量對紅曲色素含量的影響

由圖6可知，抗壞血酸添加量在0.5%～1.5%的范圍內(nèi)，紅曲色素含量緩慢上升，在1.5%～2%內(nèi)，紅曲色素含量急速上升，當(dāng)抗壞血酸添加量由2%逐漸增加到2.5%時，紅曲色素含量呈下降趨勢，且在抗壞血酸添加量為2%時，紅曲色素含量達(dá)到最大值。由于紫色紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的最佳條件為中性偏酸，而少量抗壞血酸的添加使發(fā)酵環(huán)境逐漸偏酸性，利于紅曲色素的積累，當(dāng)抗壞血酸添加量超過2%時過酸的發(fā)酵環(huán)境開始抑制紫色紅曲霉的生長[19]。

2.3 不同發(fā)酵條件對M. purpureus固態(tài)發(fā)酵豆渣產(chǎn)紅曲色素影響的單因素實驗

2.3.1 基質(zhì)初始含水量的影響

在豆渣中加入蒸餾水，得到不同初始含水量(30%、40%、50%、60%和70%)的基質(zhì)，在接種量10%條件下，按1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)14 d，考察初始含水量對發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 基質(zhì)初始含水量對紅曲色素含量的影響

由圖7可知，當(dāng)初始含水量從30%增加到50%時，紅曲色素含量逐漸上升，當(dāng)初始含水量從50%增加到60%時，紅曲色素含量急速下降，初始含水量從60%增加到70%時，紅曲色素含量緩慢降低后趨于平穩(wěn)。初始含水量在50%時，紅曲色素含量達(dá)到最大值。造成上述現(xiàn)象的主要原因是初始含水量低使得紫色紅曲霉生長受到抑制，到發(fā)酵后期，由于微生物對水分的消耗及蒸發(fā)損失造成物料較干，抑制微生物生長。當(dāng)含水量過高時，減少了基質(zhì)內(nèi)氣體的交換，不利于微生物生長[20]。鄭虹等[7]以大米和玉米的混合物為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，含水量約為57%時紅曲色素含量較高；王金字等[9]以糯米為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，在初始含水量為50%時紅曲色素含量最高；Babitha等[21]以菠蘿蜜種子粉為基質(zhì)，50%的含水量條件下產(chǎn)色素效果較好。可以看出，初始含水量在50%左右時，紫色紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素效果較好。

2.3.2 接種量的影響

接種量的多少會影響到整個發(fā)酵的效果，一般要求適量。通常采用大的接種量可以縮短菌體繁殖達(dá)到高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機(jī)會，但接種量過大也會導(dǎo)致單位體積內(nèi)養(yǎng)料和溶氧不足，干擾菌體繁殖代謝[16]。在豆渣中加入15 mL蒸餾水，設(shè)置不同接種量(2%、4%、6%、8%、10%)，按1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)14 d，考察接種量對發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8 接種量對紅曲色素含量的影響

由圖8可知，當(dāng)接種量從2%增加到8%時，紅曲色素含量呈現(xiàn)先緩慢上升，后急速上升的趨勢。當(dāng)接種量大于8%時，紅曲色素含量呈現(xiàn)下降趨勢，從而確定豆渣培養(yǎng)基產(chǎn)紅曲色素的最佳接種量為8%。

2.3.3 發(fā)酵時間的影響

在豆渣中加入15 mL蒸餾水、接種量10%條件下，按1.2.2分別發(fā)酵培養(yǎng)6、8、10、12、14 d，考察發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，發(fā)酵時間從6 d逐漸增加到12 d時，紅曲色素含量也隨之增加，且在發(fā)酵時間為12 d時，紅曲色素含量達(dá)到最大值。微生物發(fā)酵都有一個最佳時間，發(fā)酵時間過短，不利于目標(biāo)產(chǎn)物(紅曲色素)的積累，發(fā)酵時間過長，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗及多種代謝產(chǎn)物的積累導(dǎo)致環(huán)境不利于菌體生長，導(dǎo)致紅曲色素含量下降[22]。

圖9 發(fā)酵時間對紅曲色素含量的影響

2.4 正交實驗優(yōu)化

結(jié)合單因素實驗結(jié)果，固定豆渣初始含水量50%、接種量8%、發(fā)酵時間12 d，以甘油添加量(A)、NaNO3添加量(B)、KH2PO4添加量(C)、MgSO4添加量(D)和抗壞血酸添加量(E)為考察因素，以紅曲色素含量為響應(yīng)值，采用Latin.lnk正交設(shè)計助手設(shè)計L16(45)的五因素四水平正交實驗，正交實驗因素水平見表1，正交實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 正交實驗因素水平

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

由表2可知，5個因素對M.purpureus固態(tài)發(fā)酵豆渣產(chǎn)紅曲色素的影響程度大小順序為抗壞血酸添加量>甘油添加量>KH2PO4添加量>NaNO3添加量>MgSO4添加量。固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組合為A2B2C1D2E3，即：甘油6%，NaNO30.04%，KH2PO40.3%，MgSO40.2%，抗壞血酸2.2%。在優(yōu)化的培養(yǎng)基組合下進(jìn)行3次驗證實驗，紅曲色素含量可達(dá)(6.03±0.11)mg/g。

3 結(jié) 論

(1)從大米、去皮大豆粉、大豆粉、豆渣和小麥麩皮5種固體基質(zhì)中篩選出廉價的大豆制品加工副產(chǎn)物——豆渣作為適宜生產(chǎn)紅曲色素的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)。

(2)采用單因素實驗和正交實驗，確定以紫色紅曲霉固態(tài)發(fā)酵豆渣產(chǎn)紅曲色素的優(yōu)化培養(yǎng)基組成為豆渣初始含水量50%，添加甘油6%、NaNO30.04%、KH2PO40.3%、MgSO40.2%、抗壞血酸2.2%；最佳培養(yǎng)條件為控制濕度60%～65%、接種量8%、30℃發(fā)酵12 d。在最佳條件下，發(fā)酵豆渣中紅曲色素含量可達(dá)(6.03±0.11)mg/g。

(3)以豆渣為主要原料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素具有良好的可行性和經(jīng)濟(jì)性。一方面經(jīng)紫色紅曲霉發(fā)酵的豆渣可作為提取生產(chǎn)紅曲色素的原料，另一方面富含生物活性物質(zhì)的紅曲豆渣可直接作為功能性生物飼料或紅曲制劑，可顯著提高豆渣的利用度和附加值。