欒正云，黃 燕，沙 敏，徐 捷，葉 軍，郭 婷

（泰州市人民醫(yī)院 中心實驗室，江蘇 泰州225300）

單核細胞在調(diào)節(jié)炎癥和參與炎性反應中發(fā)揮重要作用。外周血單核細胞依據(jù)CD14、CD16 的表達強度分為三個亞群：Mon1、Mon2、Mon3，其中Mon1 具有吞噬、蛋白水解及促炎作用[1]，還能分泌促炎因子及粘附分子，能向發(fā)揮促炎作用的M1 型巨噬細胞分化，發(fā)揮免疫清除功能[2]。在炎癥刺激的情況下，Mon2 單核細胞上的CD163被刺激并脫落，Mon2向Mon1轉(zhuǎn)變[3]。這些不同亞群的單核細胞在疾病發(fā)生、發(fā)展中具有重要的意義。目前對單核細胞或單個核細胞檢測結(jié)果受標本放置時間的影響有較多研究[4-7]，但有關標本放置時間對單核細胞中不同亞群檢測結(jié)果的影響尚未見相關研究。我們比較標本采集后不同的放置時間對單核細胞不同亞群檢測結(jié)果的差異，為單核細胞不同亞群的臨床檢測和科研工作提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 流式細胞儀（FACSCalibur，美國BD）產(chǎn)品，用CELLQuest軟件（美國BD）獲取和分析實驗數(shù)據(jù)。

1.1.2 試劑 CD45-PerCP （Code NO:347464）、CD14-FITC（Code NO:347493）和同型對照Mouse IgG2a-FITC(Code NO:349051)由BD Bioscience 公司提供；PE Mouse Anti-Human CD16(Clone:3G8)同型對照Mouse IgG1-PE（Clone:349043）由BD Phamingen公司提供。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及保存 樣本來源于完全隨機法選擇的20例我院健康體檢者，所有受試者均于空腹抽取外周靜脈血2mL，EDTA-K2抗凝，標本第一次檢測于采集后1小時之內(nèi)，隨后在25℃放置4小時、8小時測定。

1.2.2 標本染色處理 將試管分為兩組，測定組加 入CD45-PerCP 和CD14-FITC、CD16－PE 各20μL，對照組加入CD45-PerCP 和Mouse IgG2a－FITC、Mouse IgG1-PE各20μL；將標本充分混勻，分別加50μL標本于上述兩管中，震蕩器上充分混勻，避光放置15min；分別加入溶血素各2mL，充分震蕩，避光放置10min。1500rpm 離心5 min 棄上清，各加入生理鹽水2mL 震蕩，1500rpm 離心5min 棄上清，各加入生理鹽水100μL，充分震蕩混勻，待測。

1.2.3 流式細胞儀器設置及數(shù)據(jù)分析 用FACSComp 調(diào)整儀器前向角（FSC）、側(cè)向角（SSC）、熒光一（FL1）、熒光二（FL2）、熒光三（FL3）的電壓及補償。以SSC 為縱坐標，分別以FSC、CD45、CD14為橫坐標獲取數(shù)據(jù)，在三種圖上分別選定單核細胞群設門，用CELLQuest 軟件獲取2000 個單核細胞進行分析，分析Mon1、Mon2、Mon3的比例。

1.3 統(tǒng)計學處理 研究采用SigmaPlot 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，文中正態(tài)分布數(shù)據(jù)以x+s表示。兩組間比較樣本放置時間對檢測結(jié)果影響時采用配對t 檢驗進行分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

表1 標本放置不同時間對單核細胞Mon1亞群檢測結(jié)果比較（%）

2 結(jié)果

2.1 標本放置時間對不同設門檢測單核細胞亞群的影響 20 例樣本采集后1 小時內(nèi)、室溫放置4小時、8小時檢測，不同設門方法對檢測Mon1、Mon2、Mon3結(jié)果的比較（見表1、2、3）。結(jié)果顯示：樣本放置8 小時與1 小時內(nèi)相比較，F(xiàn)SC-SSC的設門方法、CD14設門方法檢測的Mon2群細胞顯著上升（P＜0.05），Mon3群細胞顯著下降（P＜0.05）；而CD45設門方法，隨著時間的延長，Mon1群細胞顯著上升（P＜0.05），Mon3 細胞顯著下降（P＜0.05）。而8 小時與4 小時內(nèi)比較，F(xiàn)SC-SSC 設門時Mon2顯著升高（P＜0.05），而CD45 設 門、CD14 設門檢測Mon3 細胞顯著下降（P＜0.05），其余不同設門方法Mon1、Mon2、Mon3 比例均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

2.2 不同時間點FSC-SSC 設門檢測單核細胞亞群的分析（見圖1、表4）標本室溫條件下，隨著放置時間的延長，單核細胞SSC 方向檢測信號下降（見圖2）。隨著時間的延長，單核細胞出現(xiàn)分群，SSC檢測信號較高的群（SSChi）和SSC檢測信號較低的群（SSClow），其Mon1、Mon2、Mon3 表達見表1。結(jié)果顯示，與樣本放置4小時相比，樣本放置8 小時，SSClowMon1、Mon2、Mon3 的比例有顯著性差異（P＜0.05），而SSChi中Mon1、Mon2、Mon3的比例無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 標本放置不同時間對單核細胞Mon2亞群檢測結(jié)果比較（%）

表3 標本放置不同時間對單核細胞Mon3亞群檢測結(jié)果比較（%）

標本室溫條件下放置4小時，SSClow與SSChi相比Mon1、Mon3 有 顯 著 性 差 異（t=17.946，P＜0.001；t=12.177，P＜0.001)），Mon2 相比無顯著性差異（t=0.232，P=0.821）。而室溫放置8 小時，SSClow與SSChi相比Mon1、Mon2、Mon3 均有顯著性差異（t=8.278，P＜0.001；t=2.864，P=0.019；t=7.323，P＜0.001）。

表4 不同時間點SSChi、SSClow單核細胞亞群分析

圖1 標本放置不同時間單核細胞不同亞群的表達（R1：SSChi，R2：SSCdim）

2.3 標本放置不同時間CD45 設門檢測單核細胞亞群的分析 采用CD45 設門檢測單核細胞亞群時，隨著標本放置時間的的延長，SSC 方向檢測信號下降，放置8小時，單核細胞SSC方向信號與淋巴細胞分界不明顯，見圖2。

圖2 不同時間CD45設門方法

3 討論

研究顯示，標本采集時間對檢測結(jié)果有較大的影響[4-7]。如汪毅、馬南花等研究標本放置時間對單核細胞分類計數(shù)影響[4,5]。宋建新等研究了標本放置溫度及時間對外周血CD34+細胞及單個核細胞（MNC）計數(shù)結(jié)果的影響[6]。連文萍等報道血液檢驗結(jié)果與血標本放置時間的關系，結(jié)果顯示，血清K+在1h 后即明顯升高,血清Cl-于4h 后明顯下降，而Na+稍有下降。單核細胞與血小板隨著血液標本放置2h后明顯提高，放置4h后白細胞計數(shù)明顯減低[7]。

我們觀察標本放置時間對不同的設門方法檢測單核細胞亞群結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，樣本放置8 小時，F(xiàn)SC-SSC 的設門方法、CD14 設門方法Mon2 群細胞顯著上升，Mon3 群細胞顯著下降?？赡艿脑蚴?，單核細胞亞群在一定程度上代表了不同的分化發(fā)育階段，隨著Mon1 到Mon2 到Mon3細胞不斷成熟，因此隨著時間的延長，一部分Mon1 轉(zhuǎn)化為Mon2，而一部分Mon2 轉(zhuǎn)化為Mon3，一部分Mon3 死亡。但因Mon1 數(shù)量較高，Mon2 數(shù)量較低，因此隨著時間的延長，Mon2 的比例上升，而Mon3 比例下降。CD45 設門的方法與標本放置的時間有關，隨著時間的延長，Mon1群細胞顯著上升，Mon3細胞顯著下降。其原因除上述因素外，我們還觀察到，隨著時間的延長，細胞形態(tài)發(fā)生改變，室溫放置4小時單核細胞SSC的信號下降、FSC 信號增加，出現(xiàn)明顯分群現(xiàn)象（見圖2）。并且隨著放置時間從4 小時延長到8 小時，SSChi/SSClow顯著下降。其中出現(xiàn)SSCloww群中部分細胞與淋巴細胞SSC方向信號重合，我們對SSChi和SSClow分析顯示，SSChi中Mon3 細胞顯著低于SSClow中Mon3細胞。因此采用CD45設門時導致部分單核細胞群轉(zhuǎn)到淋巴細胞中，而Mon3絕大多數(shù)處于這部分主要細胞內(nèi)（見圖2），所以導致Mon3比例下降。因此標本采集后放置時間對單核細胞亞群的檢測結(jié)果影響較大。

綜上所述，為確保檢測結(jié)果的準確性，室溫保存條件下，對單核細胞亞群檢測應在采集6 小時內(nèi)送檢。