嚴(yán)華美 趙 琬 張星燦 畢辰辰 楊 瑛

(上海市閔行區(qū)疾病預(yù)防控制中心 上海 201101)

2017年上海市報(bào)告發(fā)現(xiàn)的人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者中,經(jīng)性傳播占96.3%,其中男男同性傳播為57.7%,異性傳播為38.6%,同性傳播已成為上海市HIV-1的主要傳播途徑[1]。男男性行為(men who have sex with men,MSM)人群HIV-1感染率高、隱匿性較強(qiáng),是HIV-1防治的重點(diǎn)目標(biāo)人群,相關(guān)措施也應(yīng)根據(jù)其獨(dú)有特征來開展。隨著我國(guó)抗病毒治療的逐漸深入,在巨大的藥物選擇壓力下,HIV-1耐藥問題已引起廣泛關(guān)注[2]。由于MSM的多性伴、高流動(dòng)性,該人群的HIV-1分子亞型及原發(fā)性耐藥監(jiān)測(cè)顯得至關(guān)重要。本研究從MSM感染者與一般男性感染者的相關(guān)特征比較來探討可能更適宜該人群的防控措施,對(duì)HIV-1亞型及耐藥進(jìn)行分析,為該人群的抗病毒治療策略提供依據(jù)。

資料和方法

研究對(duì)象2014年上海市閔行區(qū)疾病預(yù)防控制中心艾滋病實(shí)驗(yàn)室新確認(rèn)的男性HIV感染者中經(jīng)同性感染97名,異性感染26名。對(duì)兩者做相關(guān)特征比較,從經(jīng)同性途徑感染的樣本中隨機(jī)抽出55份進(jìn)行HIV-1亞型及原發(fā)性耐藥分析。

HIV核酸提取使用德國(guó)QIAGEN 公司生產(chǎn)的QIAcube HT cador Pathogen 96 QIAcube HT kit和QIAcube HT Plastic ware及200 μL血漿按照說明書要求提取核酸。

HIV序列擴(kuò)增使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及巢式PCR方法擴(kuò)增HIV的pol基因的蛋白酶編碼區(qū)及逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū),擴(kuò)增試劑盒使用Takara One Step RNA PCR kit(AMV)和Takara EX Taq [寶生物工程(大連)有限公司],擴(kuò)增引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成,引物詳見表1。反應(yīng)條件為:第一輪PCR,50 ℃、30 min,94 ℃、2 min,94 ℃、30 s,55 ℃、30 s,72 ℃、1 min 30 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃、10 min,4 ℃保溫;第二輪PCR,94 ℃、1 min,94 ℃、1 min,63 ℃、1 min,72 ℃、2 min,3個(gè)循環(huán);94 ℃、30 s,63 ℃、30 s,72 ℃、1 min 20 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃、10 min,4 ℃保溫。

PCR產(chǎn)物電泳使用毛細(xì)管電泳儀QIAxcel DNA 及QIAxcel DNA Screening kit對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳,目的片段約1.2 kb。PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序委托上海毆易生物科技有限公司完成。

序列整理及分析使用Squencer 4.9 軟件對(duì)原始序列進(jìn)行拼接和編輯。將整理好的序列用Treemaker工具建立系統(tǒng)進(jìn)化樹并提交至美國(guó)拉莫斯國(guó)家實(shí)驗(yàn)室HIV核酸序列庫(kù)(http://www.hiv.lanl.gov)及美國(guó)斯坦福大學(xué)的HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)(http://hivdb.stanford.edu)進(jìn)行HIV亞型判定及耐藥性分析。本研究對(duì)出現(xiàn)潛在低度耐藥及以上水平的耐藥突變進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),判斷依據(jù)2009年WHO的耐藥監(jiān)測(cè)突變列表。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 18.0軟件,對(duì)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

MSM感染者與一般男性感染者相關(guān)特征比較2014年閔行區(qū)新發(fā)現(xiàn)的MSM HIV感染者最小17歲,最大74歲,平均年齡(30.6±9.7)歲。一般男性感染者最小24歲,最大77歲,平均年齡(44.1±15.0)歲。將年齡分層后發(fā)現(xiàn),MSM感染者主要集中在25～34歲年齡層(55.7%),一般男性感染者主要集中在≥35歲年齡層(65.4%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.84,P=0.001);MSM人群婚姻狀況以未婚為主(69.1%),一般男性感染者以已婚為主(57.7%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.54,P=0.001);MSM人群文化程度以大專及以上為主(54.6%),一般男性感染者以初、高中為主(69.2%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.32,P=0.006);MSM感染者樣本主要來源于檢測(cè)咨詢(60.8%),一般男性感染者主要來源于醫(yī)療機(jī)構(gòu)(50.0%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.03,P=0.002),具體見表2。

表1 HIVpol基因PCR擴(kuò)增及測(cè)序引物Tab 1 PCR primers used for amplification and sequencing of HIV pol

表2 MSM感染者與一般男性感染者相關(guān)特征比較Tab 2 The characteristics of infected MSM compared to heterosexual infected male [n(%)]

VCT:HIV voluntary counseling and testing.

HIV-1亞型分析55例樣本共擴(kuò)增出48條序列,擴(kuò)增率87.3%。以CRF01_AE亞型為主,共28例(58.3%),其次為CRF07_BC亞型,共10例(20.8%),URF_0107亞型3例(6.3%),B亞型和CRF55_01B各2例,CRF08_BC,URF BC及CRF68_01B各1例。將序列構(gòu)建進(jìn)化樹如圖1所示。

圖1 上海市閔行區(qū)48例MSM HIV陽(yáng)性感染者系統(tǒng)進(jìn)化樹
Fig 1 Phylogenetic tree analysis of 48 HIV positive MSM from Minhang District,Shanghai

HIV-1原發(fā)性耐藥48條序列中有12條出現(xiàn)耐藥突變位點(diǎn),其中10條出現(xiàn)潛在低度耐藥,2條出現(xiàn)低度及以上耐藥。NRTI突變位點(diǎn)2個(gè),為V75L和K70R,前者引起D4T、DDI潛在低度耐藥,后者引起AZT中度耐藥,D4T低度耐藥,BC、DDI、TDF潛在低度耐藥;NNRTI突變位點(diǎn)11個(gè),其中V179D/E位點(diǎn)10個(gè),E138G位點(diǎn)1個(gè),前者引起對(duì)EFV、ETR、NVP、RPV的潛在低度耐藥,后者引起對(duì)EFV、ETR、NVP、RPV的低度耐藥,PIs突變位點(diǎn)1個(gè),為 K20I,引起NFV的潛在低度耐藥。按WHO的耐藥標(biāo)準(zhǔn),本次耐藥率為4.2%。具體如表3所示。

討 論

MSM人群在我國(guó)沿海及北部地區(qū)早已經(jīng)成為艾滋病流行的三大核心人群之一[3]。2014年上海市閔行區(qū)男性新發(fā)HIV感染者中,經(jīng)同性感染占75.2%,為HIV感染的主要途徑。本研究中30.9%的MSM感染者有過婚姻,其高感染率及作為傳播給異性的橋梁人群,使其成為艾滋病防治的重要目標(biāo)人群。相比一般男性感染者,MSM感染者具有更年輕、文化程度更高、自我檢測(cè)意識(shí)較強(qiáng)的特點(diǎn)。提示針對(duì)MSM的艾滋病防治可以嘗試使用針對(duì)性更強(qiáng)的防控措施,如利用互聯(lián)網(wǎng)+促進(jìn)MSM感染者檢測(cè)HIV;通過他們常用的聊天網(wǎng)站傳遞HIV防治信息,進(jìn)行HIV相關(guān)知識(shí)互動(dòng),定位附近檢測(cè)點(diǎn)、治療機(jī)構(gòu)和醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)等信息[4-7];使用暴露前、后預(yù)防性用藥等[8-9]。

表3 MSM HIV-1感染者耐藥突變位點(diǎn)及耐藥情況Tab 3 The primary drug resistance mutation in HIV-1 infected MSM

本研究中MSM感染者HIV-1亞型仍以CRF_01AE為主,其次為CRF07_BC,這與一些研究[10-12]結(jié)果一致。本研究還擴(kuò)增出3例URF_0107亞型,2例CRF55_01B。URF_0107亞型為CRF_01AE與CRF07_BC亞型的第二代組合亞型,在Li 等[13]研究中有發(fā)現(xiàn)該亞型,CRF55_01B在2012年首次報(bào)道,已廣泛散布于我國(guó)南部和西北部多個(gè)省份[14],為MSM感染者中發(fā)現(xiàn)的一種重組流行亞型[15],說明MSM感染HIV毒株的重組速度快,并可能會(huì)陸續(xù)出現(xiàn)多種新的重組毒株,這將導(dǎo)致不同耐藥進(jìn)化模式的出現(xiàn)[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)HIV感染者的潛在耐藥突變位點(diǎn),主要以V179D/E為主,可引起EFV、ETR、NVP及RPV的潛在耐藥,與其他國(guó)內(nèi)外未治療HIV感染者突變位點(diǎn)相似[17]。針對(duì)NRTI和NNRTI的耐藥位點(diǎn)各1例,為K70R和E138G,分別出現(xiàn)在B亞型和CRF01_AE亞型,未發(fā)現(xiàn)PI相關(guān)耐藥位點(diǎn),耐藥率為4.2%,目前呈現(xiàn)低度耐藥,這與王緒琴等[11]的研究結(jié)果一致。這可能與我國(guó)一線藥物主要以NRTI和NNRTI類為主,PI主要作為二線藥物使用等因素相關(guān)。說明目前抗病毒治療方案對(duì)新發(fā)現(xiàn)感染者仍然適用。但本研究結(jié)果略高于閔行區(qū)2013年86例HIV陽(yáng)性樣本的耐藥研究(耐藥率1.2%)[18]。MSM人群具有高感染率、廣泛擴(kuò)散及多性伴等特點(diǎn),應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)該人群的HIV分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè),以及時(shí)了解疫情發(fā)展方向,為臨床治療提供相關(guān)的客觀依據(jù)。