王 宇 陳運(yùn)動(dòng) 高 政

1.江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，江蘇淮安 223002；2.江蘇慈星藥業(yè)有限公司，江蘇宿遷 223800

卡馬西平（Carbamazepine）是抗癲癇的常用藥物，是癲癇精神運(yùn)動(dòng)型發(fā)作和三叉神經(jīng)痛的首選藥物。在卡馬西平的有關(guān)物質(zhì)控制方面，中國(guó)藥典與各國(guó)外藥典均使用氰基色譜柱。在CP、USP與EP的色譜條件方法下，運(yùn)用高效液相法檢驗(yàn)時(shí)，卡馬西平主峰與EP藥典規(guī)定雜質(zhì)A以及雜質(zhì)B與雜質(zhì)D之間的分離度達(dá)不到合格要求。參考文獻(xiàn)[1-7]方法，現(xiàn)建立此有關(guān)物質(zhì)的HPLC分析方法，對(duì)其驗(yàn)證，證明其方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

AUW120D型電子天平（日本島津公司），SQP型電子天平（賽多利斯公司），安捷倫1260型高效液相色譜儀，沃特世2695/2998型高效液相色譜儀。

1.2 試劑試藥

甲醇色譜純（美國(guó) TEDIA 公司，17125121），乙腈色譜純（美國(guó) TEDIA 公司，18035024），甲酸分析純（上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司，20170203），三乙胺分析純（國(guó)藥集團(tuán)，20160323），雜質(zhì)A對(duì)照品（Lot：016326.0，含 量：99.98%，European），雜質(zhì) B對(duì)照品（Lot：AJ-028-24，含 量：99.22%，Aocs），雜 質(zhì) C 對(duì) 照 品（Lot：ESC-037-26，含 量：99.91%，Aocs），雜質(zhì) D 對(duì)照品（Lot：1205821，含量：98.76%，REFERENCE），雜 質(zhì) E對(duì) 照品（Lot：AJC-058-24，含量：99.83%，Aocs），雜 質(zhì) F對(duì) 照品（Lot：AJC-058-25，Aocs），雜質(zhì) G 對(duì)照品（Lot：AJC-118-25，含量：99.08%，Aocs），酰氯亞氨基二芐（Lot：2018051301，含量：99.64%，江蘇慈星藥業(yè)有限公司），卡馬西平（Lot：Y201801003，江蘇慈星藥業(yè)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動(dòng)相A：1000mL水中加三乙胺0.5mL甲酸0.5mL，混勻抽濾；流動(dòng)相B：1000mL乙腈中加甲酸0.25mL，混勻，抽濾，按下述梯度條件測(cè)試。見(jiàn)表1。

檢 測(cè)波 長(zhǎng)：230nm，流速：1.0mL/min，進(jìn)樣量：20μL，柱溫：30℃；色譜柱：月旭XS-C18（4.6mm×250mm，5μm）。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫明細(xì)表

表2 降解試驗(yàn)物料平衡考察結(jié)果

2.2 測(cè)定法

溶液配制。供試品溶液：取本品適量，精密稱(chēng)定，用甲醇-水（1∶1）定容，制成0.5mg/mL。

對(duì)照溶液：取供試品溶液2～50mL容量瓶，加甲醇-水（1∶1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL，置50mL量瓶中，用甲醇-水（1∶1）稀釋至刻度。

對(duì)照品儲(chǔ)備液：取酰氯亞氨基二芐、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G對(duì)照品各20mg，精密稱(chēng)定，分別置100mL量瓶中，加甲醇50mL溶解后，用水稀釋至刻度，分別制成每1mL中約含200μg的雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液。

對(duì)照品定位溶液：分別精密移取雜質(zhì)A、雜質(zhì)E對(duì)照品儲(chǔ)備液0.75mL，酰氯亞氨基二芐，、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5mL，分別置100mL量瓶中用稀釋劑定容。在分別移取5mL到10mL量瓶中用稀釋劑定容（雜質(zhì)A，雜質(zhì)E為0.75μg/mL，酰氯亞氨基二芐、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G為0.5μg/mL）。

對(duì)照品混合溶液：分別精密移取雜質(zhì)A、雜質(zhì)E 對(duì)照品儲(chǔ)備液0.75mL，酰氯亞氨基二芐、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5mL，置同一100mL量瓶中用稀釋劑定容。在移取5mL到10mL量瓶中用稀釋劑定容。

系統(tǒng)適用性溶液：分別精密移取雜質(zhì)A、雜質(zhì)E對(duì)照品儲(chǔ)備液0.75mL，酰氯亞氨基二芐、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5mL，供試品儲(chǔ)備液25mL，置同一100mL量瓶中用稀釋劑定容。在移取5mL到10mL量瓶中用稀釋劑定容。

精密量取系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照品混合溶液、供試品溶液、對(duì)照溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。系統(tǒng)適用性溶液中各雜質(zhì)分離度要≥1.5，供試品溶液中如有與對(duì)照品溶液中雜質(zhì)保留時(shí)間一致的色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

2.3 專(zhuān)屬性

分別取本品50mg，精密稱(chēng)定，置50mL量瓶中，用溶劑甲醇-水（1∶1）稀釋?zhuān)趶?qiáng)堿、強(qiáng)酸、強(qiáng)氧化、高溫條件下破壞后，室溫放置24h；在光照條件下破壞5d進(jìn)行強(qiáng)降解實(shí)驗(yàn)。同法制備相應(yīng)破壞的空白溶液。精密量取各降解實(shí)驗(yàn)溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，報(bào)告溶劑對(duì)檢測(cè)的干擾，報(bào)告系統(tǒng)適用性溶液中雜質(zhì)的分離情況，計(jì)算物料平衡。試驗(yàn)結(jié)果表明溶劑不干擾其他雜質(zhì)和主成份檢測(cè)，對(duì)照品混合溶液中各雜質(zhì)間分離度＞1.5。強(qiáng)制降解試驗(yàn)中主要降解產(chǎn)物的峰純度合格，物料平衡在90%～110%之間。見(jiàn)表2、圖1。

圖1 分離度色譜圖

2.4 檢測(cè)限與定量限

精密量取檢測(cè)限溶液和定量限溶液各20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見(jiàn)表3。

表3 檢測(cè)限、定量限結(jié)果（μg/mL）

2.5 線性范圍

配制每1mL中各約含10μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液配制各雜質(zhì)項(xiàng)下線性溶液，各精密量取20μL，注入液相色譜儀。記錄各濃度的色譜峰面積，以峰面積A對(duì)濃度C（μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得出各雜質(zhì)的線性回歸方程，線性范圍。雜質(zhì)A為0.5395～3.2370μg/mL（y=20.012x+0.794，r=0.9962，n=6），雜質(zhì) B 為 0.4985～ 2.9910μg/mL（y=60.679x+1.2167，r=0.9995，n=6），雜 質(zhì) C 為0.5075～ 3.0450μg/mL（y=67.349x-0.8307，r=0.9995，n=6），雜質(zhì) D 為 0.5080～ 3.0480μg/mL（y=89.659x-4.208，r=0.9999，n=6），雜 質(zhì) E為 0.5050～ 3.0300μg/mL（y=32.231x+3.8737，r=0.9973，n=6），雜質(zhì) F1為 0.4950～ 2.9700μg/mL（y=62.706x+0.7887，r=0.9998，n=6），雜 質(zhì) F2 為0.4950～ 2.9700μg/mL（y=14.772x+3.0857，r=0.9962，n=6），雜質(zhì) G 為 0.5180～ 3.1080μg/mL（y=61.868x+6.2873，r=0.9986，n=6）， 雜質(zhì)酰氯亞氨基二芐為0.5080～3.0480μg/mL（y=32.855x+1.1273，r=0.9986，n=6），各雜質(zhì)線性方程的相關(guān)系數(shù)R2≥0.990，y軸截距在100%響應(yīng)值的25%以?xún)?nèi)，線性良好。

2.6 準(zhǔn)確度

溶液配制：

對(duì)照品儲(chǔ)備液1：用甲醇-水（1∶1）稀釋?zhuān)瞥擅?mL中含雜質(zhì)A和雜質(zhì)E各約10μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

對(duì)照品儲(chǔ)備液2：用甲醇-水（1∶1）稀釋?zhuān)瞥擅?mL中各約含10μg的酰氯亞氨基二芐、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)F和雜質(zhì)G對(duì)照品儲(chǔ)備液。

樣品溶液：取本品50mg，精密稱(chēng)定，置50mL量瓶中，精密稱(chēng)定，加甲醇25mL使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL中約含卡馬西平1mg的供試品溶液。

準(zhǔn)確度溶液：取本品50mg，精密稱(chēng)定，置50mL量瓶中，按限度水平50%、100%、150%的相應(yīng)濃度，精密量取雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液1和雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液2，分別加入各已有樣品的量瓶中，加甲醇25mL使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。每濃度水平的準(zhǔn)確度溶液平行配制3份。

測(cè)定：精密量取上述溶液各20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別計(jì)算各個(gè)濃度水平的單個(gè)和平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，各濃度3份溶液中單個(gè)和平均回收率在90%～110%之間；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤10%。

2.7 精密度

重復(fù)性試驗(yàn)取準(zhǔn)確度項(xiàng)下溶液，參考文獻(xiàn)[8-11]方法，重復(fù)進(jìn)樣6次，各雜質(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均≤8%。中間精密度試驗(yàn)為不同研究員，在不同日期，使用不同液相色譜儀，按重復(fù)性試驗(yàn)同法操作，各雜質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均≤10%。

2.8 耐用性

取雜質(zhì)儲(chǔ)備液、對(duì)照品混合溶液和供試品溶液，對(duì)照溶液，于室溫條件和冷藏條件下放置，參考文獻(xiàn)[12-15]方法，在一定的時(shí)間間隔取樣測(cè)定，計(jì)算雜質(zhì)儲(chǔ)備液、對(duì)照品混合溶液在不同穩(wěn)定性時(shí)間點(diǎn)各峰面積，計(jì)算待測(cè)物質(zhì)峰面積RSD，比較供試品溶液在各穩(wěn)定性時(shí)間點(diǎn)的雜質(zhì)檢出情況。

改變色譜條件：與正常條件相比較，在改變色譜柱溫度為 25℃、35℃、流速 0.9mL/min、流速1.1mL/min以及更換色譜柱條件下，考察供試品溶液中雜質(zhì)的變化。對(duì)照品儲(chǔ)備液、對(duì)照品溶液穩(wěn)定性在相應(yīng)穩(wěn)定性時(shí)間點(diǎn)峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均≤5%，雜質(zhì)＜0.2%，絕對(duì)差值在±0.05%，雜質(zhì)檢出個(gè)數(shù)沒(méi)有差異。

3 討論

通過(guò)對(duì)此卡馬西平有關(guān)物質(zhì)方法的驗(yàn)證，各項(xiàng)驗(yàn)證數(shù)據(jù)均符合中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，從而證明此方法在準(zhǔn)確度、專(zhuān)屬性、耐用性等方面表現(xiàn)良好。目前，各個(gè)國(guó)家藥典中均選用氰基色譜柱，當(dāng)氰基柱在使用四氫呋喃做流動(dòng)相時(shí)，色譜柱的壽命很短，且長(zhǎng)期使用柱效下降。其中，USP方法為超高效液相法，對(duì)儀器儀器與耗材要求嚴(yán)格，成本較高。而運(yùn)用CP方法與EP方法高效液相檢驗(yàn)時(shí)，卡馬西平主峰與雜質(zhì)A以及雜質(zhì)B與雜質(zhì)D之間的分離度達(dá)不到合格要求，不能實(shí)現(xiàn)所有雜質(zhì)的分離，導(dǎo)致雜質(zhì)限度檢驗(yàn)不準(zhǔn)確。此有關(guān)物質(zhì)的HPLC檢查方法，方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠，建議中國(guó)藥典采用此方法進(jìn)行卡馬西平有關(guān)物質(zhì)檢查。