李樹華 鄧偉 毛洪波 秦麗

中耳膽脂瘤是耳鼻咽喉科的常見病之一。膽脂瘤本質為炎癥反應包裹的囊性物質[1],是由脫落壞死的復層鱗狀上皮組織、纖維組織、角化物、膽固醇結晶等物質堆積形成。其主要臨床體征為鼓膜穿孔以及對聽骨鏈、乳突、顱骨等周圍骨質的漸進性、侵蝕性、溶骨性的破壞,導致聽力下降及顱內外嚴重并發(fā)癥[2]。文獻報道，膽脂瘤的溶骨作用主要是由于膽脂瘤上皮、肉芽組織等釋放的蛋白水解酶對細胞外基質的降解所致[3]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一組重要的降解酶家族,主要作用機制為通過降解組織細胞外基質(extracellular matrixc，ECM),破壞正常的組織形態(tài),促進腫瘤細胞的浸潤、轉移等發(fā)展過程[4]。研究表明,MMP-13和MMP-9在多種腫瘤細胞中呈現高表達狀態(tài),對腫瘤細胞的浸潤等特性起到重要促進作用[5,6]。因此,本研究擬通過檢測在中耳膽脂瘤中的MMP-13和MMP-9分布及表達水平,觀察二者與骨質破壞程度的相互關系,進一步探討中耳膽脂瘤對周圍骨質破壞的可能機制。

資料與方法

1 一般資料

選取2013年6月～2017年8月我院耳鼻咽喉科收治的中耳膽脂瘤患者的手術標本，共176例，男女之比為 11∶7,年齡 6～65 歲,平均（37.5±18.3）歲。每例均獲取中耳膽脂瘤上皮組織及正常的外耳道皮膚。所有標本均經有經驗的兩位病理科醫(yī)師檢查、證實。所有患者或家屬均簽署知情同意書。

2 試劑

鼠抗人MMP-9多克隆抗體,兔抗人MMP-13多克隆抗體,SP試劑盒等均購自上海越研生物科技有限公司。

3 評判標準

3.1 MMP-13和MMP-9的分布及表達水平判定

陽性細胞判定：細胞膜或細胞質出現棕黃色顆粒。采用多媒體彩色免疫組化病理圖像分析系統(tǒng)對染色結果進行定量分析,同時對陽性細胞表達的平均光密度（IOD）作定量分析。

3.2 中耳膽脂瘤侵襲能力評定[7]

根據術中所見評定中耳膽脂瘤上皮組織對聽骨鏈的破壞及周圍骨質的侵犯范圍：無明顯聽小骨破壞為 (+),破壞砧骨為 (++),破壞砧骨和錘骨為(+++),破壞砧骨、錘骨、乳突天蓋和/或乙狀竇骨板為(++++)。

4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件包進行分析、處理。平均光密度值采用均數±標準差(xˉ±s)表示,分析采用t檢驗及Spearman相關性分析,檢驗水準α=0.05,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 MMP-13和MMP-9在中耳膽脂瘤組織及正常外耳道皮膚中的表達

MMP-13和MMP-9蛋白在中耳膽脂瘤組織及正常外耳道皮膚的各層細胞中均有不同程度的表達,主要位于細胞質內。在中耳膽脂瘤上皮組織內的表達呈中等至強陽性,以基底層表達最強；而在正常外耳道皮膚組織中表達呈弱陽性或陰性（圖a、b、c、d）。

2 MMP-13和MMP-9在膽脂瘤上皮組織和正常皮膚組織陽性例數的IOD及相關性分析

MMP-13蛋白在兩組陽性例數的IOD分別為0.261±0.031 和 0.249±0.023（P＜0.01）,MMP-9 蛋白在兩組陽性例數的IOD分別為0.252±0.021和0.235±0.015（P＜0.05）。經 Spearman 相關分析,二者表達存在正相關（r=0.653,P＜0.01）,見表 1。

表1 MMP-13和MMP-9在膽脂瘤上皮組織和正常皮膚組織陽性例數的IOD

3 MMP-13和MMP-9陽性表達與膽脂瘤侵襲能力的關系

通過Spearman相關分析MMP-13和MMP-9的IOD顯示：膽脂瘤骨質破壞程度與膽脂瘤上皮組織中MMP-13和MMP-9均呈正相關性（r分別為：0.657、0.589；P＜0.01）。MMP-13 和 MMP-9 表達的IOD越大,膽脂瘤骨質破壞程度就越強,見表2。

表2 MMP-13和MMP-9的IOD與中耳膽脂瘤骨質破壞程度的關系

討論

近年來,中耳膽脂瘤對骨質破壞機制的研究越來越引起了國內外學者的關注,但仍對骨質破壞的發(fā)生、發(fā)展等作用機制尚不明確。膽脂瘤是由囊內容物、上皮組織、細胞外基質等物質共同構成,其本質并非傳統(tǒng)意義上的腫瘤,但它卻具有腫瘤的某些生物學特性。研究結果表明,膽脂瘤上皮組織的過度增殖可能與上皮組織下血管周圍基質降解有關,它具有促進微血管增生的能力[8],這也可能是膽脂瘤組織對破骨和溶骨機制發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一[2]。

MMP-13與MMP-9是基質金屬蛋白酶家族（MMPs）中重要的成員。MMP-13又稱膠原酶-13，在MMPs瀑布式的活化級聯(lián)反應進程中起著調節(jié)、樞紐的作用，即它不僅受到多種MMPs因子的調節(jié),活化后共同參與ECM的降解過程，還能活化MMP-2和MMP-9等因子促進腫瘤細胞的侵襲、轉移等作用[9,10]。MMP-9是一種明膠酶，活化后成為Ⅳ型膠原酶。而Ⅳ型膠原酶存在于ECM中。因此,活化后MMP-9可以直接降解ECM，促進生理性和病理性溶骨的發(fā)生、發(fā)展過程[11]。文獻報道,MMPs導致軟骨退行性改變的發(fā)生、發(fā)展過程的結論已經被廣泛認可,MMP-13與MMP-9在軟骨細胞外基質的降解過程中具有重要作用[12]。本文目的旨在,研究MMP-13與MMP-9在中耳膽脂瘤的表達以及與周圍骨質破壞的關系,分析其相互租用機制?，F將實驗結果做如下分析：

本實驗中,發(fā)現MMP-13與MMP-9蛋白表達主要定位于胞質中,與文獻報道一致。通過對表達蛋白進行平均光密度值的檢測,可以看到兩者在膽脂瘤上皮細胞的胞質呈現高表達,而在正常外耳道皮膚組織中呈現低表達或不表達,經過對兩者蛋白IOD值的Spearman相關分析,說明MMP-13與MMP-9應該與膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展相關,且兩者存在正相關性。實驗中還發(fā)現,當降低MMP-13抗體濃度時,MMP-9蛋白表達IOD值亦會降低,反之依然。說明膽脂瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中應該受到MMP-13對MMP-9的調節(jié)作用。

通過研究MMP-13和MMP-9陽性表達與膽脂瘤侵襲能力關系,我們可以看到膽脂瘤患者以+++級為主,即砧骨和錘骨的破壞。通過查閱文獻[2,3],本文結論與文獻報道相符。通過分析說明,中耳膽脂瘤上皮組織中MMP-13和MMP-9表達對周圍骨質的破壞有密切相關性。其侵襲機制,可能是MMP-13作為中心調節(jié)樞紐,活化、啟動下一級密碼MMP-9形成Ⅳ型膠原酶,降解ECM中的Ⅳ型膠原酶和促進微血管增生，導致膽脂瘤上皮的過度增值,直接參與骨質的破骨、溶骨等進程。

本研究,從理論上進一步闡明了MMP-13和MMP-9與中耳膽脂瘤的相關性,為該疾病的發(fā)生、發(fā)展、侵襲機制等提供了理論參考依據。由于該疾病發(fā)病機制尚不明確,且具有復雜性和多樣性等特點,給臨床診療工作帶來了諸多挑戰(zhàn)。膽脂瘤發(fā)生、發(fā)展等過程的的機制仍然是目前該領域研究的熱點,需要國內外學者進一步探討和研究。