陳 煥, 牛春意,白 逍, 馬秀梅, 侯寶龍, 艾 云,2, 孫艷妮, 劉建利，王翠玲

(1.西北大學(xué) 陜西省生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069;2.西安市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，陜西 西安 710054)

天然產(chǎn)物色胺酮(Tryptanthrin, 1),系統(tǒng)命名為吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮,屬于吲哚喹唑啉酮類生物堿,是中藥大青葉和青黛及其藥用植物馬藍(lán)(Strobilanthescusia)、蓼藍(lán)(PolygonumtinctorumLour) 和菘藍(lán)(Isatistinctoria)等的主要成分之一[1-3]。色胺酮及其衍生物具有抗癌[4-6]、抗炎[7-9]、抗菌[10]及殺寄生蟲[11]等作用,特別是其抑制吲哚胺2,3-雙加氧化酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)的活性[12],引起了科研工作者對其抗癌活性的極大關(guān)注。關(guān)于色胺酮及其衍生物的研究國內(nèi)較少[12-15],國外研究較多,主要研究集中在合成方法的改進(jìn)及藥理活性的研究。

天然產(chǎn)物色胺酮的合成方法報(bào)道較多[16-23],從20世紀(jì)80年代至今,主流的合成方法(Method A)是以吲哚醌(2)和靛紅酸酐(3)為起始原料,在不同催化劑和溶劑中回流[16-20]，如圖1所示。最初,Bergman 以N-甲基哌啶為催化劑,N, N-二異丙基碳二亞胺(DIC)為脫水劑,吡啶為溶劑[16]。但是，吡啶作溶劑惡臭、難聞,脫水劑DIC有劇毒,副產(chǎn)物N-取代脲分離困難。該合成工藝被三乙胺催化,甲苯回流代替,至今被廣泛應(yīng)用[10, 12, 20],由于在甲苯中反應(yīng)色胺酮產(chǎn)率不高(80%左右),后處理也不方面(大多數(shù)采用減壓蒸餾后過硅膠色譜柱分離),更簡便的合成工藝需要進(jìn)一步研究。吲哚醌還可以和鄰氨基苯甲酸縮合(Method B)[21],此方法原料易得,缺點(diǎn)是用二氯亞砜或三氯氧磷縮合,操作為無水操作,操作不便,產(chǎn)率較低。另外,可以直接用吲哚氧化縮合制備色胺酮(Method C)[22],吲哚(4)在碘化亞銅催化下,經(jīng)過氧化、縮合得到色胺酮,反應(yīng)時(shí)間過長(24 h)。此外，還有吲哚酮法(Method D)[23],以2-吲哚酮(5)為原料,用三氯氧磷作縮合劑,和鄰氨基苯甲酸甲酯縮合反應(yīng)后得到喹唑啉酮衍生物中間體,然后用醋酸酐作溶劑,和苯甲醛反應(yīng),最后用臭氧和硫甲醚處理得到色胺酮。該工藝條件的原料不易得到,反應(yīng)步驟較長,是新方法的探索。

圖1 合成色胺酮的主要方法Fig.1 Synthetic routs of synthesis of tryptanthrin

本課題組前期研究了色胺酮在菘藍(lán)中的分布情況,并發(fā)現(xiàn)了其生物合成途徑[24],在此基礎(chǔ)上用生物合成前體吲哚醌和鄰氨基苯甲酸一步仿生合成出了天然產(chǎn)物色胺酮及其衍生物[21]。此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以合成其他方法難以合成的1～4位取代的色胺酮衍生物。但是,此方法產(chǎn)率較低(合成色胺酮產(chǎn)率40.3 %),三氯氧磷對設(shè)備腐蝕性較大,只適合實(shí)驗(yàn)室制備色胺酮新衍生物。通過查閱文獻(xiàn)得知靛紅酸酐是鄰氨基苯甲酸的活化形式[25],我們發(fā)現(xiàn)色胺酮簡便的合成途徑,是以吲哚醌和靛紅酸酐縮合,這與主流的方法殊途同歸。進(jìn)一步對溶劑及堿進(jìn)行較為全面的篩選,得到了吲哚醌和靛紅酸酐的最佳合成工藝路線:在三乙胺作用下,在氯仿中回流3.0 h,可以簡便生成色胺酮(圖2)。整個(gè)反應(yīng)所用的原材料易得,反應(yīng)條件溫和,后處理只需要抽濾、乙醇洗滌,產(chǎn)品純度可達(dá)到99.9%,適合實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)化生產(chǎn)。用此方法合成了一系列衍生物,對合成的色胺酮及其衍生物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征并初步進(jìn)行抑制腫瘤細(xì)胞增值的活性研究。

圖2 色胺酮類化合物簡便的合成方法Fig.2 Convenient rout of synthesis of tryptanthrins

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

吲哚醌(純度98%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，阿法埃莎化學(xué)有限公司);靛紅酸酐(純度98%,阿法埃莎化學(xué)有限公司);色胺酮標(biāo)準(zhǔn)(Sigama 公司);四氫呋喃、甲苯(分析純,天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);二氧六環(huán)、乙醇、N, N-二甲基甲酰胺、氯仿、二氯甲烷(分析純,天津化學(xué)試劑廠);乙腈(色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);三乙胺(分析純,福晨化學(xué)試劑有限公司);NaOH，Na2CO3，NaHCO3，NH4HCO3，NaHSO3，Na2SO4，CH3COOK(分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司);CH3COONH4(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);濃H2SO4、濃HCl、丙胺(n-propylamine)、異丙胺(isopropylamine)、叔丁胺(t-butylamine)、CH3COOH(分析純,鄭州通捷化工產(chǎn)品有限公司);6-氯吲哚醌、6-溴吲哚醌(化學(xué)純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、5-氯吲哚醌、5-甲基吲哚醌、5-甲氧基吲哚醌等自制[26]。

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、人肺癌細(xì)胞株A549、大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤的PC12細(xì)胞株(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心);MTT,DMEM-F12培養(yǎng)液,胎牛血清,青霉素(100 units/mL),鏈霉素(100 mg/mL) (Hycolone公司);吉非替尼(分析純,99.5%,創(chuàng)賽科技有限公司)。

1H NMR用Bruker AM-400或者Agilent DD2 600 MHz型核磁共振光譜儀測定(TMS為內(nèi)標(biāo));MS用 Thermo Ulitimate 3000-TSQ測定;紅外用NEXU 470型傅里葉紅外光譜分析儀測定;X-5顯微熔點(diǎn)測定儀(北京泰克匯光科技有限公司),溫度計(jì)未校正; DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(陜西太康生物科技有限公司);恒溫水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);MCO-1SAC型細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO);LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);DT5-2 型低速臺式離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司);超速冷凍離心機(jī)(5424R型,德國Eppendorf公司);SHA-C 恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司);倒置顯微鏡(DMIL-LED,Leica);移液槍(德國Eppendorf公司);酶標(biāo)儀(Spetitral Max 190,Molecular Device);超凈工作臺(BHC-1300ⅡB2,蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色胺酮及其衍生物的合成 在裝有磁子,冷凝管和溫度計(jì)的100 mL三頸瓶中,加入吲哚醌(或其衍生物)0.01 mol,靛紅酸酐1.71 g,三氯甲烷40 mL,三乙胺1.5 mL,加熱回流3.0 h. 冷卻,過濾得到色胺酮(色胺酮衍生物)的粗品。產(chǎn)物用10 mL乙醇洗滌3次,得到純品色胺酮(或色胺酮衍生物)。

用此方法合成化合物15個(gè),并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,結(jié)果與目標(biāo)化合物一致。

所合成化合物表征如下:

吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1):

黃色針狀晶體,2.31 g,產(chǎn)率:93.1%,熔點(diǎn): 268～269℃。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.62(d,J=8.1Hz,1H), 7.79 (dd,J=8.1, 7.7Hz, 1H), 7.43(t,J=7.7Hz, 1H), 7.91(d,J=7.7Hz, 1H), 8.03(d,J=8.1Hz, 1H), 7.85(ddd,J=8.1, 7.3, 1.4Hz, 1H), 7.67(dd,J=7.3, 7.9Hz, 1H), 8.44(dd,J=7.9, 1.4Hz, 1H)。

IR(KBr)v/cm-1: 3127.8, 1595.4, 1458.2 (C6H6), 1724.3 (CO), 1689.6 (CO), 757.64 (苯環(huán)上有4個(gè)鄰接氫)。

ESI-MSm/z: 理論值(C15H8N2O2):248.23,測量值:248.19 [M]+。

8-氟吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1a):

黃色固體,2.35 g,產(chǎn)率:88.3%,熔點(diǎn): 273-276℃。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.70 (dd,J=8.8, 4.1 Hz, 1H), 8.50 (dd,J=7.9, 1.3 Hz, 1H), 8.09(d,J=8.1 Hz, 1H), 7.92 (m,J=7.6 Hz,1H), 7.75 (t,J=7.6 Hz, 1H), 7.64 (dd,J=6.5, 2.7 Hz,1H), 7.55 (td,J=8.6, 2.7 Hz, 1H)。

IR (KBr)v/cm-1: 3090, 1594.3, 1484.8,1457.1 (C6H6), 1731.6 (CO), 1678.6 (CO), 1123.3 (F), 837.05 (苯環(huán)上有2個(gè)鄰接氫), 722.19 (苯環(huán)上有4個(gè)鄰接氫)。

ESI-MSm/z: 理論值(C15H7FN2O2):266.23,測量值:267.11 [M+H]+。

8-氯吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1b)

黃色固體, 2.36g,產(chǎn)率:83.7%,熔點(diǎn): 297～298℃。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.60 (d,J=8.5 Hz, 1H), 8.44 (d,J=7.9 Hz, 1H), 8.04 (d,J=8.1Hz, 1H), 7.87 (t,J=7.6 Hz, 2H), 7.77-7.67 (m, 2H)。

IR (KBr)v/cm-1: 3072.8, 1595.4, 1460.7 (C6H6), 1732.2 (CO), 1674.4 (CO), 843.5 (苯環(huán)上有2個(gè)鄰接氫), 722.43 (苯環(huán)上有4個(gè)鄰接氫)。

ESI-MSm/z: 理論值(C15H7ClN2O2):282.68,測量值:283.15 [M+H]+。

8-溴吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1c)

黃色固體,2.65g,產(chǎn)率:81.0%,熔點(diǎn): 307～309℃。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.54 (d,J=8.5 Hz, 1H), 8.43(d,J=8.0 Hz,1H), 8.07-7.99(m, 2H), 7.92-7.84 (m, 2H), 7.70 (t,J=7.6 Hz, 1H)。

IR(KBr)v/cm-1: 3069,1593, 1457 (C6H6), 1732.9 (CO), 1677.6 (CO), 840.37 (苯環(huán)有2個(gè)鄰接氫), 767.97(苯環(huán)有4個(gè)鄰接氫)。

ESI-MSm/z: 理論值(C15H7BrN2O2)327.14,測量值:327.23 [M]+。

碘吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1d)

黃色固體,3.01g,產(chǎn)率:80.5%,熔點(diǎn): 303～305℃。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)δ:8.41 (t,J=7.4 Hz, 2H), 8.21 (s, 1H), 8.15-7.96 (m, 2H), 7.86 (t,J=7.7 Hz, 1H), 7.69 (t,J=7.5 Hz, 1H)。

IR(KBr)v/cm-1: 3059.3,1589.4, 1456.4 (C6H6), 1732.9 (CO), 1676.7 (CO), 845.36 (苯環(huán)有2個(gè)鄰接氫), 771.38 (苯環(huán)有4個(gè)鄰接氫)。

ESI-MSm/z: 理論值(C15H7IN2O2):374.14,測量值:374.39[M]+。

8-甲基吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1e)

黃色固體,2.41g,產(chǎn)率:92.0%,熔點(diǎn): 281～282℃。

1HNMR (400 MHz, CCl3)δ: 8.34 (dd,J=14.7, 7.9 Hz, 2H), 7.94 (dt,J=9.4, 4.5 Hz, 2H), 7.79-7.66 (m, 3H), 2.42 (s, 3H)。

IR(KBr)v/cm-1: 3063,1591.2, 1482.4 (C6H6), 1728.7 (CO), 1684.9 (CO), 2924,1337.9 (CH3), 829.5 (苯環(huán)有2個(gè)鄰接氫), 775.7(苯環(huán)有4個(gè)鄰接氫)。

ESI-MSm/z: 理論值(C16H10N2O2):262.27,測量值:262.25[M]+。

8-硝基吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1f)

黃色固體,2.30g,產(chǎn)率 78.5%, 熔點(diǎn): 275～276℃。

1HNMR (400 MHz, CCl3)δ: 8.87 (d,J=8.8 Hz, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.74-8.66 (m, 1H), 8.48 (d,J=8.1 Hz, 1H), 8.08 (d,J=7.9 Hz, 1H), 7.93 (t,J=7.2 Hz, 1H), 7.75 (t,J=7.5 Hz, 1H)。

IR (KBr)ν/cm-1: 3032, 1608.26, 1590.21 (C6H6), 1733.6 (CO), 1676 (CO), 1523.7, 1343.4 (NO2), 853.8 (苯環(huán)有2個(gè)鄰接氫), 725 (苯環(huán)有4個(gè)鄰接氫)。

ESI-MSm/z: 理論值(C15H7N3O4): 293.24,測量值:293.21 [M]+。

7-氯,8-氟吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮/8-氟,9-氯吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1g):

黃色固體,2.75 g,產(chǎn)率91.7%,熔點(diǎn): 284～289℃。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.60 (dd,J=8.7, 3.5 Hz, 1H), 8.43 (d,J=7.7 Hz, 1H), 8.08-7.98 (m, 1H), 7.87 (t,J=7.5 Hz, 1H), 7.76-7.62 (m, 1H), 7.53 (t,J=8.7 Hz, 1H)/8.78 (d,J=5.8 Hz, 1H), 8.43 (d,J=7.7 Hz, 1H), 8.08-7.98 (m,1H), 7.87 (t,J=7.5 Hz, 1H), 7.76-7.62 (m, 2H)。

IR(KBr)ν/cm-1: 3034,1595.4, 1469.7, 1461 (C6H6), 1735.1 (CO), 1685.3 (CO), 838.13(苯環(huán)有2個(gè)鄰接氫), 776.38 (苯環(huán)有4個(gè)鄰接氫)。

ESI-MSm/z: 理論值(C15H6ClFN2O2):300.01,測量值:301.16 [M+H]+。

7,9-二甲基吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1h):

黃色固體,2.20 g,產(chǎn)率:79.7%,熔點(diǎn): 282～283℃

1HNMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.43 (dd,J=7.9, 1.3 Hz, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.03 (d,J=8.0 Hz, 1H),7.86-7.81 (m, 1H), 7.65 (t,J=7.6 Hz, 1H), 6.98 (s, 1H), 2.69 (s, 3H), 2.49 (s, 3H)。

IR(KBr)ν/cm-1: 3030, 1586.8 1458.6 (C6H6), 1722.4 (CO), 1685 (CO), 2988, 2959, 2923, 2841,1285.3(CH3), 895.8(苯環(huán)含有孤立氫), 776 (苯環(huán)有4個(gè)鄰接氫)。

ESI-MSm/z: 理論值(C17H12N2O2):276.30,測量值:276.25 [M]+。

7,8-二氯吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮/8,9-二氯吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1i):

黃色固體,2.8 g,產(chǎn)率:88.3%,熔點(diǎn): 269～274 ℃。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)δ: (δ8.57 (d,J=8.6 Hz, 1H), 8.44 (d,J=7.7 Hz, 1H), 8.09-8.02 (m, 1H), 7.89 (t,J=7.7 Hz, 1H), 7.84 (d,J=8.6 Hz, 1H), 7.71 (td,J=7.6, 3.7 Hz, 1H)/8.81 (s, 1H), 8.44 (d,J=7.7 Hz, 1H), 8.09-8.02 (m, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.89 (t,J=7.7 Hz, 1H), 7.71 (td,J=7.6, 3.7 Hz, 1H)。

IR(KBr)ν/cm-1: 3087,1596.5, 1450.6, 1402 (C6H6), 1732.7 (CO), 1687.8 (CO), 896.11(苯環(huán)含有孤立氫), 836.68 (苯環(huán)有2個(gè)鄰接氫), 775 (苯環(huán)有4個(gè)鄰接氫)。

ESI-MSm/z: 理論值(C15H6Cl2N2O2): 317.13,測量值:318.33[M+H]+。

7-氯吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1j):

黃色固體,2.16 g,產(chǎn)率:76.6%,熔點(diǎn): 304～306 ℃。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)δ:δ8.70 (s, 1H), 8.45 (d,J=7.8 Hz, 1H), 8.05 (d,J=8.1 Hz, 1H),7.88 (dd,J=12.9, 7.8 Hz, 2H), 7.71 (t,J=7.6 Hz, 1H), 7.42 (d,J=8.1 Hz, 1H)

IR (KBr)v/cm-1: 3036, 1586.4, 1461,1429.7(C6H6), 1733.2 (CO), 1692.8 (CO), 780.66(苯環(huán)有3個(gè)鄰接氫), 772(苯環(huán)有4個(gè)鄰接氫)。

ESI-MSm/z: 理論值(C15H7ClN2O2):282.68,測量值:283.15 [M+H]+。

9-溴吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1k):

黃色固體,2.80 g,產(chǎn)率:85.6 %,熔點(diǎn): 297～301℃。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.66 (d,J=1.6 Hz, 1H),8.34 (d,J=7.9 Hz, 1H), 8.02-7.93 (m, 2H),7.85 (d,J=8.0 Hz,1H),7.80-7.70 (m,2H)。

IR (KBr)v/cm-1: 3056.9, 3029.3, 1589.2, 1460,1420.8 (C6H6), 1727.6 (CO), 1687.5 (CO), 881 (苯環(huán)有孤立氫), 843.2 (苯環(huán)有2個(gè)鄰接氫), 773.9 (苯環(huán)有4個(gè)鄰接氫)。

ESI-MSm/z: 理論值(C15H7BrN2O2):327.14,測量值327.19 [M]+。

7-氯,8-甲基吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1l):

黃色固體,2.5g,產(chǎn)率84.5%,熔點(diǎn):278～279℃。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.47 (d,J=8.2 Hz, 1H), 8.43 (d,J=7.8 Hz, 1H), 8.05 (d,J=8.0 Hz, 1H), 7.86 (t,J=7.5 Hz, 1H), 7.68 (t,J=7.5 Hz, 1H), 7.63 (d,J=8.1 Hz, 1H), 2.47 (s, 3H)。

IR(KBr)ν/cm-1: 3065.3,1596.1,1585.9,1460 (C6H6), 1730.3 (CO), 1687.3 (CO), 2979, 2923, 1342(CH3), 887.3 (苯環(huán)有孤立氫), 831(苯環(huán)有2個(gè)鄰接氫), 774 (苯環(huán)有4個(gè)鄰接氫)。

ESI-MSm/z: 理論值(C16H9ClN2O2):296.04,測量值:296.27 [M]+。

7,10-二甲基吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1m):

黃色固體,2.10 g,產(chǎn)率:76.1%,熔點(diǎn): 283～284℃。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.46-8.39 (m, 2H), 8.02 (d,J=8.0 Hz, 1H), 7.84 (t,J=7.5 Hz, 1H), 7.71-7.63 (m, 2H), 2.45 (s, 3H), 2.35 (s, 3H)。

IR (KBr)ν/cm-1: 3031, 1595.7, 1460 (C6H6), 1731 (CO), 1691 (CO), 2974.4, 1381.4 (CH3), 887.84 (苯環(huán)有2個(gè)鄰接氫), 76.19 (苯環(huán)有4個(gè)鄰接氫)。

ESI-MSm/z:理論值(C17H12N2O2):276.30,測量值:276.25 [M]+。

7,8-二甲基吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮/8,9二甲基吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1n):

亮黃色固體,2.28 g,產(chǎn)率:82.6%,熔點(diǎn):279～282℃。

1HNMR (600 MHz, CDCl3)δ: 8.42 (dt,J=6.6, 3.3 Hz, 1H), 8.33 (d,J=8.1 Hz, 1H), 8.01 (dd,J=8.0, 1H), 7.867.81 (m, 1H), 7.68 7.63 (m, 1H), 7.48 (d,J=8.1 Hz, 1H), 2.68 (s, 3H), 2.34 (s, 3H),8.42 (dt,J=6.6, 3.3 Hz, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.01 (dd,J=8.0, 1H), 7.86 7.81 (m, 1H), 7.687.63 (m, 2H), 2.45 (s, 3H), 2.34 (s, 3H)。

IR(KBr)ν/cm-1: 3031.7, 1616,1595.8, 1460 (C6H6), 1721.1 (CO),1685.7 (CO), 2926.6, 1356.6(CH3), 906.35(苯環(huán)含有孤立氫), 887.98 (苯環(huán)有2個(gè)鄰接氫), 776.86(苯環(huán)4個(gè)鄰接氫),ESI-MSm/z:理論值(C17H12N2O2):276.30，測量值:276.26 [M]+。

1.2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞A549，HCT116及PC12,消化,計(jì)數(shù),以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板,在細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃,體積分?jǐn)?shù)為5%CO2)無菌培養(yǎng)24 h,加入不同濃度的化合物(吉非替尼為陽性對照,每個(gè)化合物設(shè)3個(gè)平行孔),空白溶劑做對照,加藥培養(yǎng)48 h。48 h后，吸出培養(yǎng)基,加入180μL的培養(yǎng)基以及20μL配好的MTT溶液(5 mg/mL),培養(yǎng)4 h。4 h 后，吸出培養(yǎng)基,加入180μL的DMSO,放于37℃恒溫器,振蕩15 min。最后，用酶標(biāo)儀在490nm處檢測其吸光值,根據(jù)公式:抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD平均值/對照組OD平均值)×100%,計(jì)算細(xì)胞增值抑制率及IC50值[27],結(jié)果見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 色胺酮及其衍生物的合成

圖3 色胺酮及其衍生物結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of tryptanthrin derivatives

色胺酮及其衍生物的合成按照圖2所示的合成路線和條件進(jìn)行合成。以吲哚醌及其衍生物和靛紅酸酐在三乙胺作用下,在氯仿中回流,合成出了色胺酮及其衍生物(見圖3)。其中，1g，1h，1i，1l，1m 這5個(gè)色胺酮衍生物為本實(shí)驗(yàn)首次合成報(bào)道,在美國化學(xué)文摘沒有檢索到相關(guān)報(bào)道,可認(rèn)為新化合物,通過IR，1H NMR，MS對所合成的化合物進(jìn)行了表征,與目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)一致。

由于吲哚醌衍生物是由取代苯胺合成[26],那些不對稱的苯胺中間體關(guān)環(huán)生成吲哚醌衍生物時(shí)存在同分異構(gòu)(經(jīng)HPLC分離和氫譜核磁確證)[28],而且不易分離,最終導(dǎo)致色胺酮的衍生物1i，1g，1n在7或9位取代也存在同分異構(gòu)體。

圖4 色胺酮衍生物1i的結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Structure of tryptanthrin derivative1i

對同分異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)確證,可以通過1HNMR核磁解析。1i產(chǎn)生2個(gè)同分異構(gòu)體,8,9-二氯吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1i′)和 7,8-二氯吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(1i")。從核磁解析可以分辨出存在同分異構(gòu)體,2個(gè)同分異構(gòu)體在A 環(huán)上1-4位氫的化學(xué)環(huán)境一樣,因此位移是相同的。A 環(huán)在圖譜上各個(gè)位置氫的數(shù)目為 1i ′和1i″在同一位置氫數(shù)目之和,例如,在化學(xué)位移8.44處就有兩個(gè)氫。其主要的區(qū)別是 D 環(huán)上氫的位移和裂分情況不同,1i ′的 C7 和 C10 位,都有一個(gè)氫,由于鄰位都沒有氫,因此出單峰,分別位于化學(xué)位移8.81和7.98處。1i"的C9和 C10位氫之間相互影響,理論上應(yīng)該裂分成兩個(gè)二重峰,化學(xué)位移8.57有一個(gè)氫的二重峰,歸屬為C10。由于C9和C3位(1i ′和1i″)的化學(xué)位移相近,因此兩者在化學(xué)位移7.71～7.89附近重合形成多重峰,數(shù)目為兩個(gè)位置上氫數(shù)目之和即3個(gè)氫。同分異構(gòu)體的解析過程,化學(xué)位移7.98和8.81處的單峰是重要的標(biāo)志峰，這說明7，10位單峰的存在。

因而，1i為2個(gè)同分異構(gòu)體:1i′:1HNMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.81 (s, 1H), 8.44 (d,J=7.7 Hz, 1H), 8.09-8.02 (m, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.89 (t,J=7.7 Hz, 1H), 7.71 (td,J=7.6, 3.7 Hz, 1H);1i":8.57 (d,J=8.6 Hz, 1H), 8.44 (d,J=7.7 Hz, 1H), 8.09-8.02 (m, 1H), 7.89 (t,J=7.7 Hz, 1H),7.84 (d,J=8.6 Hz, 1H), 7.71 (td,J=7.6, 3.7 Hz, 1H)。1g和1n的結(jié)構(gòu)確證與1i類似。

2.2 酸堿對反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)對吲哚醌和靛紅酸酐反應(yīng)的體系進(jìn)行了研究。分別以氯仿和乙醇為溶劑,加入不同的酸和堿,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),部分堿促進(jìn)反應(yīng)的發(fā)生。

以n(吲哚醌)∶n(靛紅酸酐)∶n(酸或堿)按照1∶1∶1加料,分別在氯仿、乙醇中回流反應(yīng)3.0h,對酸堿進(jìn)行篩選，結(jié)果如表1所示。以氯仿為溶劑時(shí),加入三乙胺反應(yīng)產(chǎn)率最高,達(dá)到92.7 %。加入乙酸鉀,產(chǎn)率也可達(dá)30.0 %,其余的堿和酸對反應(yīng)幾乎沒有促進(jìn)作用。但是,當(dāng)以乙醇為溶劑時(shí),無機(jī)堿NaOH，Na2CO3，NaHCO3以及CH3COOK對反應(yīng)有促進(jìn)作用,產(chǎn)率不高(分別為37.3 %,42.4 %,40.0 %,16.0 %),其余的酸和堿作用下很少或沒有色胺酮生成。CH3COOK以氯仿和乙醇為溶劑時(shí),都可以產(chǎn)生色胺酮,但是產(chǎn)率不高?？傊?以吲哚醌、靛紅酸酐為原料合成色胺酮時(shí),用氯仿為溶劑、三乙胺對反應(yīng)促進(jìn)作用最強(qiáng),合成色胺酮產(chǎn)率最高。

表1 不同溶劑和酸堿對色胺酮產(chǎn)率的影響Tab.1 Yield of tryptanthrin in different solvent and acids or bases

a(-: no target compound.)

2.3 溶劑的選擇

以吲哚醌和靛紅酸酐為原料,加入三乙胺,考察不同溶劑中反應(yīng)情況。以n(吲哚醌)∶n(靛紅酸酐)∶n(三乙胺)按照1.0∶1.0∶1.0加料,回流3.0h, 對溶劑進(jìn)行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原料吲哚醌和靛紅酸酐在氯仿中反應(yīng)產(chǎn)率最高92.7 %,二氯甲烷中反應(yīng)產(chǎn)率為78.8%,甲苯中產(chǎn)率為52.0%,在四氫呋喃、N,N-二甲基甲酰胺及二氧六環(huán)中產(chǎn)率較低分別為32.2 %，31.8%及28.2 %,在乙醇中反應(yīng)產(chǎn)率最低14.9 %。因而,選擇產(chǎn)率較高的氯仿為溶劑。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對反應(yīng)的影響

以吲哚醌和靛紅酸酐為原料, 在三乙胺作用下, 在氯仿中回流,對反應(yīng)條件中反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。 以n(吲哚醌)∶n(靛紅酸酐)∶n(三乙胺)按照1.0∶1.0∶1.0加料,氯仿為溶劑,反應(yīng)2.0h,3.0 h,4.0 h,5.0 h,反應(yīng)產(chǎn)率分別為70.6%,92.7%,89.1%,88.3%。由此可以看出,3.0 h后反應(yīng)產(chǎn)率并沒有增加,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,副反應(yīng)會增多,導(dǎo)致產(chǎn)率下降,較適宜的反應(yīng)時(shí)間為3.0 h。

2.5 物料比對反應(yīng)的影響

以吲哚醌和靛紅酸酐為原料,在三乙胺作用下,在氯仿中回流合成色胺酮,考察物料比對反應(yīng)的影響。

主要反應(yīng)原料n(吲哚醌)∶n(靛紅酸酐)按照1.0∶1.0反應(yīng)時(shí),理論上是理想的。但是我們在反應(yīng)結(jié)果的雜質(zhì)檢測中,只檢測到吲哚醌并沒有檢測到靛紅酸酐,可能靛紅酸酐在反應(yīng)過程中分解,溶于溶劑中了。為了讓吲哚醌盡量反應(yīng)完全,在產(chǎn)品中減少殘留。故,選擇靛紅酸酐量稍微過量。

以n(吲哚醌)∶n(三乙胺)按照1.0∶1.0加料不變,n(吲哚醌)∶n(靛紅酸酐)按照1.0∶1.0,1.0∶1.05,1.0∶1.1分別在氯仿中回流3.0h,反應(yīng)結(jié)果為92.7 %,93.1 %,91.9 %。可見,靛紅酸酐過量,對產(chǎn)率并沒有較大的增加,稍微過量為好,過量太多造成不必要的浪費(fèi),在實(shí)際反應(yīng)中選擇以n(吲哚醌)∶n(靛紅酸酐)按照1∶1.05加料。

在本實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)三乙胺加量少,反應(yīng)時(shí)間延長,產(chǎn)率低,為此考察三乙胺對反應(yīng)的影響。此反應(yīng)控制吲哚醌在產(chǎn)品中的殘留,盡量減少吲哚醌的殘留,為此選擇不同吲哚醌和三乙胺物料比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

以n(吲哚醌)∶n(靛紅酸酐)按照1.0∶1.0加料不變,n(吲哚醌)∶n(三乙胺)按照1.0∶0.6,1.0∶1.0,1.0∶1.4分別在氯仿中回流3.0h,反應(yīng)結(jié)果為66.5 %,92.7 %,89.1 %。吲哚醌與三乙胺的物料比對色胺酮產(chǎn)率影響較大。當(dāng)三乙胺和吲哚醌的物質(zhì)的量一樣或過量,能更快地促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行,但是三乙胺不能過量太多造成資源浪費(fèi)和過高堿性廢液的產(chǎn)生,因而選擇n(吲哚醌)∶n(三乙胺)按照1.0∶1.0較為適宜。

綜上,合成色胺酮較優(yōu)的條件為n(吲哚醌)∶n(靛紅酸酐)以1.0∶1.05,n(吲哚醌)∶n(三乙胺)以1.0∶1.0,在氯仿中回流3.0 h。用此條件重復(fù)3次,反應(yīng)結(jié)果一致性較好(93.1%, 92.7%,91.9%)。

2.6 反應(yīng)后處理

對色胺酮的反應(yīng)結(jié)果處理,第一次反應(yīng)結(jié)束經(jīng)過硅膠色譜柱分離得到純品。經(jīng)過對反應(yīng)原料和產(chǎn)物的溶解性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物色胺酮在乙醇中極微溶,在氯仿中、二氯甲烷中略溶解,而吲哚醌、靛紅酸酐及三乙胺溶于乙醇。因而,后處理采用反應(yīng)結(jié)束抽濾,用乙醇洗滌的方法,發(fā)現(xiàn)用乙醇洗劑三次純度可以達(dá)到99.9%,后處理方便,避免采用減壓蒸去溶劑及過柱分離(耗時(shí)、耗溶劑)。

2.7 色胺酮衍生物的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系

MTT(噻唑藍(lán))法是檢測細(xì)胞存活和生長的常用方法,該方法廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。

本論文用MTT法對合成的色胺酮及其衍生物進(jìn)行了初步抗腫瘤活性檢測,選用人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、 人肺癌細(xì)胞株A549、 大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 初步選用化合物作用的終濃度濃度為:100, 50, 25, 12.5 , 6.25,3.125 μmol/L;初步實(shí)驗(yàn)后,對于抑制活性好的化合物進(jìn)一步用低濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn):12.5,6.25,3.125,1.562,0.78125,0.3906μmol/L,實(shí)驗(yàn)處理結(jié)果見表2。

表2 色胺酮體外抗腫瘤細(xì)胞增值Tab.2 In vitro antiproliferative activitis of tryptanthrins

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多數(shù)帶有吸電基團(tuán)的色胺酮衍生物相比色胺酮抗腫瘤活性有所增強(qiáng)。其中,8, 9位被吸電子基團(tuán)取代的色胺酮衍生物的抗腫瘤效果好。8-NO2色胺酮和8,7/9-二氯色胺酮衍生物對A549，HCT116及PC12 3個(gè)腫瘤細(xì)胞系都具有較好的抑制作用(IC50分別為:1.47，1.35，3.28 μmol/L;0.99，5.11，1.60 μmol/L),優(yōu)于陽性對照吉非替尼(Gifitininb,GFTN)的抑制活性(5.44，6.46，45.31 μmol/L);8-F，8-Cl，9-Br，9-Cl取代的色胺酮衍生物也具有較好的活性。當(dāng)8, 9位被給電子的甲基取代或吸電作用較弱的碘取代時(shí),活性較色胺酮大大降低?？傮w而言,這些化合物對腫瘤細(xì)胞系具有較好的抑制作用。

3 結(jié) 論

本論文以吲哚醌和靛紅酸酐為原料,對堿、溶劑及投料比進(jìn)行篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)以三乙胺作為堿,在氯仿中回流3.0 h生成色胺酮的產(chǎn)率達(dá)到93.1 %,后處理抽濾,用乙醇洗滌3次,純度高(99.9%)。此合成方法簡便、后處理方便。用此方法合成出了14個(gè)衍生物,5個(gè)衍生物未見文獻(xiàn)報(bào)道。同時(shí),對合成的色胺酮及其衍生物進(jìn)行了初步的結(jié)構(gòu)和抗腫瘤細(xì)胞增值的影響研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),8, 9位被吸電子基團(tuán)取代的色胺酮衍生物的具有較好的抑制效果。例如,8-NO2色胺酮和8, 7/9-二氯色胺酮對A549，HCT116及PC12腫瘤細(xì)胞系都具有較好的抑制作用(IC50分別為:1.47, 1.35, 3.28 μmol/L;0.99, 5.11, 1.60 μmol/L),優(yōu)于陽性對照吉非替尼(GFTN,IC50=6.46, 5.4, 45.31 μmol/L);8, 9位被氟或氯單取代或雙取代對A549和PC12具有較好的抑制作用,對HCT116抑制作用較差?？傮w而言,合成的色胺酮類化合物對A549具有較好的抑制活性,在肺癌藥物的篩選方面具有潛在的應(yīng)用前景。