楊春敏 黃建初 查麗艷

1（廣州工商學(xué)院，廣東廣州 510850）2（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州 510642）

山蘭米酒是海南黎族人民配制的一種甜米酒，是海南五指山地區(qū)最受歡迎的傳統(tǒng)酒精飲料。山蘭米酒以山蘭稻釀造而成，山蘭稻是一種生長(zhǎng)在山坡上的旱稻，有山蘭紅米、山蘭黑米和山蘭糯米3種，釀制山蘭米酒主要以糯米為原料。由于山蘭米酒在糖化發(fā)酵期間以糖化過程為主，其酒精度不高，味道甘醇甜美，酒漿黏稠，乳白色中微微泛黃，入口很有質(zhì)感。

甜酒曲是釀造甜米酒的糖化發(fā)酵劑，其所含微生物種類十分豐富，組成復(fù)雜，微生物間的相互作用使釀造的米酒口感獨(dú)特，香氣濃郁。目前海南山蘭米酒多為手工作坊釀制，采用傳統(tǒng)制作工藝，微生物種類繁多且不穩(wěn)定，生產(chǎn)控制主要依靠實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，溫度、用曲量等控制不好，容易產(chǎn)生苦味，導(dǎo)致不同季節(jié)不同批次的米酒質(zhì)量不穩(wěn)定，因此研究酒曲中微生物種類、數(shù)量、代謝作用及微生物間的相互作用就顯得極其重要。大量研究發(fā)現(xiàn)酒曲中主要有三大類微生物，即霉菌、酵母菌和細(xì)菌。高通量測(cè)序技術(shù)是目前研究微生物多樣性中應(yīng)用最廣泛的測(cè)序技術(shù)，不僅能夠快速地分析復(fù)雜微生物群落多樣性，還能檢測(cè)到低存在率以及不可培養(yǎng)的微生物，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于發(fā)酵豆豉、醋、米酒、腸道微生物、酸奶等生物群落結(jié)構(gòu)研究。

目前關(guān)于山蘭米酒的研究主要集中在釀造工藝優(yōu)化及營(yíng)養(yǎng)成分分析等方面，對(duì)其微生物群落多樣性研究相對(duì)較少。本研究以采集自海南6 個(gè)山蘭米酒酒廠的酒曲為研究對(duì)象，采用IluminaMiseq 高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)細(xì)菌的16SrDNA 和真菌ITS 區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，分析海南山蘭米酒酒曲的微生物群落多樣性，明確優(yōu)勢(shì)菌群，為更好地提高山蘭米酒品質(zhì)，推動(dòng)其產(chǎn)業(yè)發(fā)展，建立現(xiàn)代化釀酒新工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海南山蘭米酒酒曲樣品：由編號(hào)為A、B、C、D、E、F 的6 個(gè)酒廠提供。

QIAGEN DNA Mini-Kit，購(gòu)于德國(guó)QIAGEN 公司；其他化學(xué)試劑，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；C1000 型PCR 儀，美國(guó)BIO-RAD 公司；電泳儀、電泳槽，北京市六一儀器廠；Gel Doc 型凝膠成像儀，美國(guó)BIO-RAD 公司；Miseq 高通量測(cè)序儀，美國(guó)Ilumina 公司；Agilent 2100 生物分析儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品總DNA 的提取

將酒曲用研缽粉碎，使用QIAGEN DNA Mini-Kit 試劑盒提取各酒曲樣品中所有微生物的總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)無明顯降解，質(zhì)量合格。DNA 樣品于-20 ℃保存，備用。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增

以1.3.1 得到的總DNA 為模板，對(duì)細(xì)菌16S rDNA 的V3-V4 區(qū)和真菌的ITS 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，具體引物見表1。

表1 細(xì)菌、真菌的PCR 擴(kuò)增引物

1.3.3 PCR 產(chǎn)物的定量、混樣及測(cè)序

按操作說明使用The Agilent DNA1000Kit 和Agilent2100 生物分析儀對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物精確定量。將所有樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物等濃度混勻至終濃度為100 nmol/L，于IluminaMiseq 高通量測(cè)序平臺(tái)上機(jī)分別對(duì)樣品中的細(xì)菌和真菌序列測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酒廠酒曲樣品的Alpha 多樣性分析

采用Alpha 多樣性指標(biāo)的Simpson、Shannon、Chao1 和ACE 指數(shù)，對(duì)采集自6 個(gè)不同酒廠的酒曲樣品中細(xì)菌和真菌的Alpha 多樣性進(jìn)行了比較分析，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 不同酒廠酒曲樣品的Alpha 多樣性比較分析

由圖1 可知，從6 個(gè)酒廠收集的酒曲樣品中，酒廠E 的酒曲樣品中細(xì)菌群落的Alpha 多樣性最高，Simpson、Shannon、Chao1 和ACE 指數(shù)都高于其他5 個(gè)酒廠，說明其細(xì)菌群落的物種豐富度及均勻度都較高。酒廠C 的酒曲樣品中真菌的Chao1 以及ACE 指數(shù)均明顯高于其余5 個(gè)酒廠（圖1GH），說明其酒曲樣品中真菌物種豐富度較高；而其細(xì)菌的Chao1 以及ACE 指數(shù)卻比較?。▓D1EF），說明酒曲樣品中細(xì)菌物種豐富度較低。這些結(jié)果表明，不同酒廠收集到的酒曲真菌和細(xì)菌Alpha 多樣性存在差異。

2.2 不同酒廠酒曲樣品的優(yōu)勢(shì)微生物組成及其相關(guān)性

通過對(duì)各酒曲樣品中的主要微生物進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌菌屬中片球菌（Pediococcus）（39.20%）、腸桿菌屬（Enterobacter）（16.06%）、魏斯氏菌Weissella（8.83%）、Klebsiella（5.04%）、Escherichia-Shigella（3.64%）、Pelomonas（1.65%）、坂崎腸桿菌Cronobacter（1.53%）、Ochrobactrum（1.35%）和Ralstonia（1.04%）的含量都超過了1%（圖2A），因此，將這些定義為核心微生物群。其中，片球菌（Pediococcus）數(shù)量最多，為39.2%。在真菌層面上，含量從高到低位列前十位的分別是：根霉（Rhizopus）、假絲酵母屬（Candida）、Bullera、Simplicillium、曲霉屬（Aspergillus）、Gibberella、Phaeoacremonium、Archae orhizomyces、Acremonium 和Chaetomium，其中根霉（Rhizopus）為樣品中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)含量大于35%（圖2C）。同時(shí)，基于Spearman 等級(jí)相關(guān)系數(shù)，對(duì)酒曲樣品中細(xì)菌及真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行了相關(guān)性分析，在細(xì)菌層面上，片球菌（Pediococcus）與其他菌屬之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，Enterobacter 與Klebsiella 呈明顯正相關(guān)（圖2B），在真菌層面上，Bullera 與假絲酵母屬（Candida）正相關(guān)性較強(qiáng)，與Gibberella 則呈明顯負(fù)相關(guān)（圖2D）。

圖2 酒曲樣品中優(yōu)勢(shì)微生物組成

2.3 不同酒廠酒曲樣品的Beta 多樣性分析

采用基于UnweightedUnifrac Distance 和Weighted Unifrac Distance 的PCoA 分析圖譜分別對(duì)酒曲樣品進(jìn)行了細(xì)菌和真菌層面上的Beta 多樣性分析，如下頁(yè)圖3 所示。代表酒廠B 和C 細(xì)菌群落的點(diǎn)均能較好的與其他酒廠區(qū)分開，結(jié)合表2 可知，酒廠B和C 的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與酒廠D、E、F 均有顯著差異，p＜0.000 1，而酒廠A、D、E、F 的細(xì)菌群落混雜程度較高，差異不顯著。從真菌層面來看，酒曲樣品中真菌的群落結(jié)構(gòu)差異小于細(xì)菌，各樣品點(diǎn)的混雜程度較高，結(jié)合表3，酒廠A 的真菌群落結(jié)構(gòu)與B 和D 差異顯著。

表2 不同酒廠的酒曲樣品基于Unweight UniFrac PC1 及Weight UniFrac PC1 的P 值（細(xì)菌）

表3 不同酒廠的酒曲樣品基于Unweight UniFrac PC1 及Weight UniFrac PC1 的P 值（真菌）

2.4 細(xì)化差異性菌屬

為進(jìn)一步研究不同酒廠的酒曲樣品在屬水平上的差異性，選取了p＜0.05 的菌屬作熱圖（圖4）。在細(xì)菌層面上，酒廠B 和C 酒曲樣品中Weissella、Bacillis 及Pantoea 含量明顯高于其他組，而Cronobacter、Enterobacter、Klebsiella 及Escherichia-Shigella 含量明顯低于其他組。同時(shí)發(fā)現(xiàn)6 個(gè)酒廠的酒曲樣品中Pediococcus 含量都特別高。在真菌層面上，酒廠E 的Wicherhamomyces 及Candida 含量明顯高于其他組，而酒廠B 的Mucor 含量明顯高于其他組，Candida 含量明顯低于其他組。同時(shí)，Bullera 在6 個(gè)酒廠酒曲中含量都比較高。

圖4 屬水平上微生物差異性

3 結(jié)論

海南山蘭米酒酒曲中細(xì)菌和真菌組成較為豐富，真菌主要有根霉屬（Rhizopus）、假絲酵母屬（Candida）、Bullera、Simplicillium、曲霉屬（Aspergillus）、Gibberella，其中根霉屬是酒曲中真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬，這與泰國(guó)甜酒和陜北傳統(tǒng)米酒一致；細(xì)菌層面主要有片球菌（Pediococcus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、魏斯氏菌Weissella、Klebsiella 等，其中片球菌含量最多。通過酒曲的細(xì)菌和真菌的Alpha 和Beta 多樣性分析以及聚類分析，酒廠E 的細(xì)菌群落物種豐富度和均勻度都比較高，而酒廠C 的細(xì)菌群落豐富度較低，真菌群落多樣性較高；通過熱圖發(fā)現(xiàn)6 個(gè)酒廠的酒曲中片球菌（Pediococcus）、Bullera 含量普遍都比較高，這可能與山蘭米酒的發(fā)酵密切相關(guān)；酒廠B 和C的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和其他酒廠具有顯著差異，酒曲某些菌屬Weissella、Bacillis、Cronobacter、Enterobacter、Klebsiella 等含量存在一致性，可以進(jìn)一步深入研究。本研究揭示了山蘭米酒細(xì)菌和真菌群落組成和不同酒廠酒曲菌屬的差異，明確酒曲中的優(yōu)勢(shì)菌種，為山蘭米酒工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

圖3 酒曲樣品的Beta 多樣性