文沛瑤,杜夢(mèng)揚(yáng),吉文麗,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

枸杞是一種傳統(tǒng)的名貴藥材,富含多糖、蛋白質(zhì)、維生素等多種活性成分,枸杞多糖是枸杞中的主要活性成分,具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤,調(diào)劑免疫等功效[1]。枸杞多糖的提取純化過程是其開發(fā)利用的一個(gè)關(guān)鍵步驟,高效的多糖提取純化方法可提高枸杞資源的利用率。

多糖的傳統(tǒng)純化方法為乙醇沉淀法,此法雖能提取出大量的多糖,但是往往存在醇沉不徹底的缺點(diǎn),致使原料利用率降低,其次醇沉過程也存在耗時(shí)長(zhǎng)、乙醇使用量大等問題[2]。因此,尋求一種高效分離多糖的純化方法顯得十分必要。三相萃取技術(shù)常用于蛋白的分離純化,若將其使用在枸杞多糖分離純化方面,可有效避開醇沉工藝,使其提取優(yōu)勢(shì)更為明顯。三相萃取法原理是通過在粗提液中加入無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑使其形成三相,上相為有機(jī)層,主要是色素、脂類等極性較小的物質(zhì),中間相為蛋白質(zhì)層,下相為水層,主要是一些水溶性物質(zhì)[3-6]。此外,體系中無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑都可回收,且具有操作簡(jiǎn)單、高效、體系容量大、可連續(xù)操作、條件溫和等特點(diǎn)[3,6]。因此,三相萃取法可作為綠色高效純化枸杞多糖的一種思路。

針對(duì)乙醇沉淀法的不足以及三相萃取法的特性,本文采用叔丁醇-(NH4)2SO4-提取液三相體系萃取枸杞多糖,探索多糖的萃取規(guī)律,為以后的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

枸杞 青海德令哈;無水乙醇、叔丁醇、(NH4)2SO4、苯酚、硫酸、蘆丁、葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鋁 均為分析純,購于天津科密毆化學(xué)試劑有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白 均購于上海索萊寶生物科技有限公司。

TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FA1204B電子分析天平 上海天平儀器廠;FX超聲波清洗儀 濟(jì)寧豐鑫超聲設(shè)備有限公司;R213B旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀、SHB-3循環(huán)真空泵 上海申生科技有限公司;PHB-4 pH計(jì)、C-MAG MS4磁力攪拌器 上海精密儀器儀表有限公司;TGL-16M冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;WJX-200高速多功能粉碎機(jī) 上海緣沃工貿(mào)公司;FD8-3T立式冷凍干燥機(jī) GOLD-SIM公司;TENSOR II傅里葉變換近紅外光譜儀 德國(guó)Bruker Optics公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 枸杞多糖提取液的制備 將10 g干枸杞原料按料液比1∶30 (g/mL)加入蒸餾水,研缽搗碎,50 ℃下水浴攪拌提取30 min,連續(xù)提取3次,過濾,合并3次濾液,濾液經(jīng)50 ℃、0.07 MPa下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至300 mL。濃縮液供三相萃取法和乙醇沉淀法分離多糖使用,其中乙醇沉淀法條件為四倍濃縮液體積乙醇沉淀24 h，得到枸杞多糖A。

1.2.2 三相萃取體系 取10 mL枸杞水提取液分別加入一定量的(NH4)2SO4,然后加入一定體積的叔丁醇配制所需三相體系。磁力攪拌5 min使兩相充分混勻,調(diào)節(jié)pH至一定值,以4000 r/min離心5 min加速相分離過程,于一定的溫度下靜置60 min,分層如圖1所示,上相主要為叔丁醇,含有部分黃酮以及一些色素,脂類雜質(zhì);中間相主要為蛋白質(zhì);下相主要是(NH4)2SO4和枸杞多糖[7]，此時(shí)獲得枸杞多糖B。使用移液器將三相各層的溶液分別吸出存于微量量筒中測(cè)定體積,測(cè)定完畢后用水稀釋各相溶液,上相、中間相、下相檢測(cè)指標(biāo)分別為黃酮、蛋白質(zhì)和多糖濃度。蛋白、多糖層通過分子透析除去無機(jī)鹽后冷凍干燥用于紅外光譜檢測(cè)和抗氧化實(shí)驗(yàn)。

圖1 三相體系萃取枸杞活性成分的分層情況

1.2.3 萃取條件的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 提取液中(NH4)2SO4添加量的確定 取10 mL提取液加入(NH4)2SO4使其質(zhì)量濃度為10%、20%、30%、40%、50%后加入15 mL叔丁醇,在萃取溫度為25 ℃,pH6條件下萃取60 min后測(cè)定各相的相應(yīng)指標(biāo),考察提取液中(NH4)2SO4添加量對(duì)體系中三種化合物的萃取率影響。

1.2.3.2 叔丁醇添加量的確定 取10 mL提取液加入(NH4)2SO4使其質(zhì)量濃度為20%后加入5、10、15、20、25 mL的叔丁醇,在萃取溫度為25 ℃,pH6的條件下萃取60 min后測(cè)定各相的相應(yīng)指標(biāo),考察叔丁醇添加量對(duì)體系中三種化合物的萃取率影響。

1.2.3.3 萃取溫度的確定 取10 mL提取液加入(NH4)2SO4使其質(zhì)量濃度為20%后加入10 mL的叔丁醇,在萃取溫度為20、25、30、35、40 ℃,pH6的條件下萃取60 min后測(cè)定各相的相應(yīng)指標(biāo),考察萃取溫度對(duì)體系中三種化合物的萃取率影響。

1.2.3.4 萃取體系pH的確定 取10 mL提取液加入(NH4)2SO4使其質(zhì)量濃度為20%后加入10 mL的叔丁醇,在萃取溫度為35 ℃,pH4、5、6、7、8的條件下萃取60 min后測(cè)定各相的相應(yīng)指標(biāo),考察萃取體系pH對(duì)體系中三種化合物的萃取率影響。

1.2.4 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取影響較大的因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),確定最佳的萃取多糖的條件。

1.2.5 多糖、蛋白質(zhì)、黃酮含量的測(cè)定 多糖含量檢測(cè)采用苯酚硫酸法測(cè)定[1],蛋白質(zhì)含量(由于中間層含量較少,可吸出稀釋定容測(cè)定)檢測(cè)采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法[8],黃酮含量檢測(cè)采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[9]。

式中,Cc、Cp、Cf分別是提取液多糖、蛋白質(zhì)、黃酮的濃度,V0是提取液體積;Ct、Cm、Cb分別是萃取液上相黃酮濃度,中間相蛋白質(zhì)濃度,下相多糖濃度,Vt、Vm、Vb分別是上相、中間相、下相體積。

其中Cc=2.14 mg/mL,CP=0.46 mg/mL,Cf=0.37 mg/mL,V0=300 mL

1.2.6 紅外光譜 分別取1.2.1中乙醇沉淀多糖(多糖A)和1.2.2下相中的多糖(多糖B),以10000 Da分子以上的多糖為研究對(duì)象,過10000 Da分子膜透析無機(jī)鹽,截留后液體冷凍干燥24 h,條件為凍干制品溫度-25 ℃,解析溫度35 ℃,稱取0.2 g凍干樣品溴化鉀壓片后進(jìn)行紅外掃描,條件為掃描波長(zhǎng)范圍為4000～400 cm-1,分辨率為2.0 cm-1。

1.2.7 DPPH自由基清除活性的測(cè)定 分別取多糖A和多糖B過10000 Da分子膜透析后的冷凍干燥,稱取0.2 g凍干樣品加入10 mL水稀釋用于測(cè)定其抗氧化活性。將2 mL的0.05～2 mg/mL不同濃度的多糖溶液與2 mL的0.25 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合,混勻后靜置30 min,以無水乙醇為參比,于517 nm處測(cè)定吸光值分別為A,維生素C為陽性對(duì)照[10]。每個(gè)樣品三組重復(fù),取平均值。樣品對(duì)DPPH自由基的清除率則為:

DPPH自由基清除率(%)=(A1-A2)×100/A1

式中:A1為加入多糖溶液反應(yīng)后的A值,A2為蒸餾水代替多糖樣品液后的A值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述方法中多糖、黃酮、蛋白質(zhì)得率實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)三次,取平均值,采用Excel軟件作圖,多糖的紅外表征采用Origin 8軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

圖2 (NH4)2SO4添加量對(duì)三相體系中枸杞多糖、蛋白質(zhì)、黃酮萃取率的影響

2.1.2 叔丁醇添加量對(duì)體系中三種化合物的萃取率影響 與其他有機(jī)溶劑相比,叔丁醇更適合三相萃取體系,而且大多數(shù)關(guān)于三相萃取法分離蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑都選用的是叔丁醇[3,12,14]。因此,本研究以叔丁醇為有機(jī)相,研究了其添加量對(duì)各個(gè)活性成分萃取效果影響。由圖3可知,隨著叔丁醇添加量的增加枸杞多糖的萃取率是先增大后減小,在叔丁醇添加量為10 mL時(shí)枸杞多糖的萃取率最大為92.73%。與此同時(shí),可溶性蛋白質(zhì)萃取率隨叔丁醇的添加量增加而下降,在叔丁醇添加量為5 mL時(shí)萃取率最大為85.11%。這一現(xiàn)象可能是由于增加叔丁醇和(NH4)2SO4的含量引起相互作用的結(jié)果。然而叔丁醇的含量過低不利于三相體系的穩(wěn)定性,使其成相困難,添加適量的叔丁醇可以增加沉淀蛋白的浮力,使蛋白質(zhì)在中間階段更加穩(wěn)定,進(jìn)一步降低了下相的可溶性蛋白質(zhì)含量[13,15]。黃酮萃取率隨著叔丁醇的添加量增加而增加,在研究范圍內(nèi)當(dāng)添加量到25 mL時(shí),其萃取率最大為80.75%。根據(jù)多糖萃取率最高的原則，體系中叔丁醇添加量為10 mL較為合適。

圖3 叔丁醇添加量對(duì)三相體系中枸杞多糖、蛋白質(zhì)、黃酮萃取率的影響

2.1.3 萃取溫度對(duì)體系中三種化合物的萃取率影響 圖4研究了溫度在20～40 ℃范圍內(nèi)對(duì)各活性成分的影響,結(jié)果顯示隨溫度增加多糖和蛋白質(zhì)的萃取率先增大后減小,黃酮萃取率緩慢增加而且幅度不大,當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)多糖萃取率最大為93.76%,30 ℃時(shí)蛋白質(zhì)萃取率最大84.32%,40 ℃黃酮萃取率最大為53.80%。在較低的范圍內(nèi)升高溫度有利于三相萃取體系的萃取效果,可能是因?yàn)殡S著溫度的升高大量的羥基的暴露促進(jìn)了更多的氫鍵或鏈接形成,從而使多糖的親水性增強(qiáng),從而在下相更集中[16]。因此綜合考慮選擇萃取溫度為35 ℃為宜。

圖4 萃取溫度對(duì)三相體系中枸杞多糖、蛋白質(zhì)、黃酮萃取率的影響

2.1.4 萃取體系pH對(duì)體系中三種化合物的萃取率影響 圖5顯示了pH對(duì)枸杞多糖和可溶性蛋白質(zhì)、黃酮的萃取率影響,當(dāng)pH從4～6時(shí),多糖和可溶性蛋白質(zhì)的萃取率在較低的階段逐漸增加,并且pH為6時(shí)多糖到達(dá)最佳萃取率94.89%。然后隨著pH的進(jìn)一步增加到7時(shí),蛋白質(zhì)的萃取率最大為82.56%。黃酮在這一pH變化范圍的萃取率變化較小,隨著pH增大有輕微的降低趨勢(shì),在pH4時(shí)其萃取率最大為52.30%。調(diào)整三相萃取體系的pH可能會(huì)影響到離子化的大分子(尤其是蛋白質(zhì)),從而改變它們的表面電荷[3,17],綜合考慮,體系pH為6最為合適。

圖5 萃取體系pH對(duì)三相體系中枸杞多糖、蛋白質(zhì)、黃酮萃取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,各單因素的變化對(duì)三種化合物的萃取率都有一定的影響。綜合考慮選10 mL提取液中(NH4)2SO4添加量、叔丁醇添加量、溫度、萃取體系pH來設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)。

從表1中可以看出,提取液中(NH4)2SO4添加量、叔丁醇添加量、溫度、pH對(duì)三相體系萃取多糖都具有一定的影響,其影響因素大小順序?yàn)樘崛∫褐?NH4)2SO4添加量、溫度、叔丁醇添加量、pH。其最佳萃取條件是:A3B2C2D2,即:提取液中(NH4)2SO4添加量為30%、叔丁醇添加量為10 mL、溫度為35 ℃、pH為6。

表1 正交試驗(yàn)的因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal array design

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiment

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)確定的最佳萃取條件,進(jìn)行3次平行試驗(yàn),此時(shí)多糖的萃取率可達(dá)95.31%±0.72%,蛋白質(zhì)萃取率可達(dá)83.45%±0.77%,黃酮萃取率可達(dá)50.66%±0.46%。

2.4 紅外光譜

FTIR圖譜顯示,在3420 cm-1附近的吸收峰是糖類分子間或分子內(nèi)的O-H 鍵伸縮振動(dòng)[18],兩種枸杞多糖的紅外光譜很相似且具備多糖特征吸收峰,這說明兩種多糖的結(jié)構(gòu)基本一致[19]。1612 cm-1附近為羧基的羰基C=O伸縮振動(dòng),可能是羧酸或羧酸鹽。1417 cm-1的峰是C-H變角振動(dòng)峰。1073 cm-1附近處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰是由C-O形成的伸縮振動(dòng)區(qū),該吸收峰是C-OH和吡喃環(huán)上的醚鍵C-O-C特征吸收峰,說明兩種枸杞多糖中都存在吡喃糖苷鍵。在1017 cm-1的吸收峰是糖苷鍵C-O-C非對(duì)稱伸縮振動(dòng),說明了多糖中都存在吡喃環(huán)構(gòu)象[20]。蛋白質(zhì)紅外圖譜中1530 cm-1附近處出現(xiàn)的峰是 N-H 變角振動(dòng)的信號(hào),表明紅外光譜圖具有酰胺結(jié)構(gòu)的特征吸收峰,由此確認(rèn)中間相萃取物為蛋白質(zhì)[21]。

圖6 枸杞多糖和蛋白質(zhì)紅外光譜圖

2.5 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基,甲醇溶液顯紫色,自由基清除劑能夠與DPPH的單電子被配對(duì),在最大吸收波長(zhǎng)處顏色變淺,吸光度也隨之變小[22]。DPPH自由基清除率越高,說明其抗氧化能力越大。其抗氧化性如圖7所示。

圖7 多糖對(duì)DPPH自由基清除能力

圖7為兩種不同純化方法所得不同濃度多糖的DPPH自由基清除活性?？梢钥闯鰞煞N多糖均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性,且隨著糖濃度增高兩者的自由基清除能力均有所增強(qiáng)。對(duì)比兩種多糖可以發(fā)現(xiàn)在樣品濃度為2 mg/mL時(shí),三相萃取的多糖(多糖B)DPPH自由基的清除率為90.11%,醇沉多糖(多糖A)DPPH自由基的清除率為88.87%,這就說明兩種方法所提取的多糖均具有良好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

三相萃取法可在萃取枸杞多糖的同時(shí)一定程度上的分離水提液中的蛋白質(zhì)和黃酮。本文研究了三相體系中的提取液中(NH4)2SO4添加量、叔丁醇添加量、萃取溫度、pH這四個(gè)因素對(duì)三相體系萃取枸杞活性的效果的影響,優(yōu)化條件發(fā)現(xiàn)提取液中(NH4)2SO4添加量為30%、叔丁醇添加量為10 mL、溫度為35 ℃、pH為6時(shí)多糖的萃取率可達(dá)95.31%,蛋白質(zhì)萃取率可達(dá)83.45%,黃酮萃取率可達(dá)50.66%。三相對(duì)其他傳統(tǒng)的方法而言,此法的枸杞活性成分綜合利用率、萃取率有了明顯提高。三相萃取體系中的無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑都可以回收重復(fù)使用,但是最優(yōu)的體系篩選和后續(xù)三相中的活性成分精制仍需進(jìn)一步研究完善。因此三相萃取法分離純化枸杞活性成分是一種具有前景的高效分離方法。