汪繼 趙浩 陳秀芬 肖宗宇 朱健偉 陳文錦 張麗 徐如祥

小膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要內在免疫細胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷時發(fā)揮主要的免疫效應[1]。腦缺血后產生的炎癥反應主要以小膠質細胞的激活以及炎癥因子的釋放為特征，而小膠質細胞過度產生炎癥因子會加速神經(jīng)元細胞的死亡[2,3]。近些年，microRNAs（miRNAs）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用引起了廣泛的關注，其不僅在膠質瘤中起重要作用，而且參與調控神經(jīng)損傷性疾病的神經(jīng)保護。miRNAs 是一類長度為19～25 個堿基的非編碼RNA，主要結合mRNA 的非翻譯區(qū)，下調或者抑制mRNA 的轉錄與翻譯。近期有研究表明miRNAs 表達的改變與缺血性腦損傷有關，其中microRNA-182（miR-182）在腦缺血性損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護性作用，但具體的調節(jié)機制尚不清楚[4-6]。本文通過生物信息分析發(fā)現(xiàn) （http://www.targetscan.org/），Toll樣體4（toll-like receptor 4, TLR4）可能是miR-182 的一個調節(jié)靶點。TLR4 是Toll 樣受體分子家族中的一種，作為一種跨膜受體，在先天性免疫反應中發(fā)揮重要的信號轉導作用，在調節(jié)神經(jīng)炎癥方面也很重要[7]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，TLR4 主要在小膠質細胞上表達，而有研究表明小膠質細胞活性的抑制能產生神經(jīng)保護效應[8]。因此miR-182 是否可以通過下調TLR4 的表達來減輕小膠質細胞激活后的炎癥反應，目前尚未研究。本研究通過熒光素酶實驗證實TLR4 是miR-182的直接靶點，miR-182 可通過抑制TLR4 的表達來減輕小膠質細胞的炎癥反應，從而為缺血缺氧性腦損傷提供潛在的治療靶點。

材料與方法

一、實驗試劑及儀器

小膠質細胞（BV2 細胞）、HEK293 細胞（購自國家細胞資源庫）；miR-182 mimics 和Negative Control（NC）、小干擾TLR4 RNA（siTLR4）和siTLR4 NC（上海吉瑪制藥技術有限公司）；TLR4（ORF）過表達和空載（vector）質粒（上海吉凱基因化學技術有限公司）；Lipofectamine 2000、TRIzol （Invitrogen 公司，美國）； 炎癥因子 （TNF-α、IL-6、IL-1β）ELISA 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；TLR4 抗體、GAPDH 抗體 （Abcam公司，美國）；qPCR SYBR Green （南京諾唯贊生物科技有限公司）； 引物合成（上海生工生物工程股份有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、Hank’s 液（Gibco 公司，美國）。

二、細胞培養(yǎng)與轉染

BV2、HEK293細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，當細胞融合90%時用0.05%的胰酶消化進行1∶3 傳代。

轉染時，將細胞培養(yǎng)于六孔板中，當細胞融合達60%～70%，利用轉染試劑Lipofectamine 2000 進行BV2 細胞的miR-182 mimics 和miR-182 mimics NC(即miR-182組和miR-182 NC 組)、siTLR4 和siTLR4 NC(即siTLR4 組和siTLR4 NC 組)以及TLR4(ORF)過表達質粒和TLR4 vector 質粒[即TLR4（ORF）組和TLR4 vector 組]的轉染，24 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收獲細胞進行后續(xù)功能實驗；Control 組未進行任何轉染。

三、氧糖剝奪實驗

采用氧糖剝奪實驗（oxygen-glucose deprivation，OGD）模擬細胞體外缺糖缺氧的環(huán)境。將細胞培養(yǎng)于正常的環(huán)境中，然后去除培養(yǎng)基，用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗2～3 遍，加入Hank’s液，同時將細胞轉入低氧培養(yǎng)箱 （5%CO2，2%O2，93%N2，37℃）培養(yǎng)6 h，后轉入普通培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收獲細胞進行后續(xù)實驗，Control 組未進行OGD 處理。

四、Western blot檢測

將培養(yǎng)皿中的細胞刮下后用PBS 洗2 遍，然后加入適量的細胞蛋白提取液，冰上裂解約30 min后，通過BCA 蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度后，按1∶4 加入5×loading buffer 95℃煮約5～10 min。按每孔30 mg 蛋白總量在10%凝膠中進行蛋白電泳，將凝膠中的蛋白通過恒流轉到PVDF 膜上，轉膜完畢后用5%的BSA 封閉約1 h，之后加入一抗4℃孵育過夜，次日取出用TBST 洗5 min，洗3 次，加入相應種屬的二抗室溫孵育1 h 后，繼續(xù)用TBST 洗5 min，洗3 次，最后通過顯影劑在曝光儀中曝光顯影。

五、RNA提取及熒光RT-PCR實驗

將細胞培養(yǎng)基洗凈后加入適量TRIzol （一個六孔板約1 mL），室溫裂解約10 min，然后加入200 μL氯仿后震蕩30 s，室溫孵育3 min，進行4℃12 000 g離心20 min，看到分成3 層，小心吸出最上水相層，加入適量異丙醇震蕩室溫孵育10 min，進行4℃12 000 g 離心10 min，棄上清加入1 mL 75%乙醇清洗，自然晾干后加入無RNA 水溶解RNA。將提取的RNA 先進行反轉錄（TAKARA 試劑盒）得到cDNA，然后加入miR-182、TLR4 以及炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β） 引物及帶有熒光染料的酶和原料的混合物等進行RT-PCR 反應，通過得到的循環(huán)值（cycle threshold, CT）來計算RNA 的相對量。

六、熒光素酶基因測定

合成一段帶有熒光素酶的TLR4 野生型（wild type，WT）及突變型（mutant，MUT）的質粒，分別與miR-182 mimics 一起進行BV2 細胞以及HEK293細胞轉染，然后加入熒光素酶鉀鹽，通過酶標儀檢測熒光強度，代表miR-182 與其堿基匹配程度。

七、酶聯(lián)免疫吸附實驗

將細胞培養(yǎng)上清取出后離心去除細胞碎片后加入預包被抗體的孔中，按照說明書進行操作，最后通過酶標儀讀出OD 值，與標準曲線進行比對后計算出相對蛋白濃度。

八、統(tǒng)計學分析

采用SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，miR-182、TLR4 mRNA 相對表達量、TLR4 蛋白灰度數(shù)值以及TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白濃度數(shù)值以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間樣本的比較采用兩樣本的t 檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

圖1 OGD 處理不同時間后小膠質細胞miR-182、TLR4 mRNA 和蛋白相對表達量

結果

一、小膠質細胞在OGD誘導下miR-182和TLR4的表達

通過測定OGD 誘導后小膠質細胞TLR4 及miR-182 的表達量，結果顯示：與0 h（未經(jīng)OGD 處理）比較，處理3、6、12 h 后TLR4 的蛋白及mRNA表達量明顯增加，而6 h 與12 h 時的TLR4 表達量比較無明顯差異； 另外與0 h 比較，BV2 細胞中miR-182 相對表達量明顯下降（圖1）。

二、熒光素酶基因報告結果

在HEK293 和BV2 細胞中，TLR4 野生型（WT）與miR-182 mimics 共轉染后較與miR-182 NC 共轉染，熒光素表達強度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而TLR4 突變型（MUT）與miR-182 mimics共轉染后較與miR-182 NC 共轉染，熒光素表達強度無明顯差異（圖2）。

圖2 熒光素酶基因測定報告結果

三、小膠質細胞中過表達miR-182 后檢測TLR4的表達

通過檢測顯示轉染miR-182 mimics 組BV2 細胞中的miR-182 明顯高于NC 組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。轉染后24 h，經(jīng)OGD 處理6 h，通過RT-PCR 及Western blot 檢測轉染后TLR4 水平，發(fā)現(xiàn)較NC 組，miR-182 mimics 組的TLR4 mRNA 及蛋白水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3）。

Western blot 檢測結果發(fā)現(xiàn)同時轉染miR-182和TLR4 （ORF） 質粒，TLR4 的表達量較轉染miR-182 和TLR4 vector 組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而較轉染miR-182 NC 和TLR4 vector組無明顯差異（圖4）。

四、小膠質細胞中同時過表達miR-182 和TLR4（ORF）后檢測炎癥因子的表達

通過檢測炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的表達發(fā)現(xiàn)，與Control 比較，miR-182組顯著降低炎癥因子的釋放，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同時，通過RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，與Control 比較，在同時轉入miR-182 及TLR4 時，炎癥因子水平無明顯改變，而轉入siTLR4 時，炎癥因子水平顯著下降且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖5）。

討論

缺血缺氧性腦損傷是導致高死亡率及高致殘率的疾病之一，至今仍無有效且安全的治療方法，所以亟需探索新的安全高效的治療手段。神經(jīng)元細胞的死亡是各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的基礎，而導致神經(jīng)元細胞死亡的機制有很多，如能量代謝的不足、細胞內Ca+超載、線粒體損傷以及炎癥反應等等，其中炎癥反應是最突出的[9]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的免疫細胞是小膠質細胞，其過度激活釋放炎癥介質會加速神經(jīng)元的死亡，所以控制過激的炎癥反應是保護神經(jīng)元細胞的有效策略[3]。TLRs 在先天免疫應答中起重要作用[10]。TLR4 主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質細胞和全身的免疫細胞上表達，而且很多的研究已經(jīng)證實TLR4 在炎癥反應中起重要作用[11]。在缺氧激活的小膠質細胞中，TLR4 介導神經(jīng)炎癥過程[12]。因此，缺氧性腦損傷激活的小膠質細胞中的TLR4 是一個潛在的治療靶點。作為特異性腦miRNA，miR-182 在無脊椎動物和脊椎動物之間是保守的，并且是成人和胚胎腦中最豐富的miRNA 之一[13]。有研究報道，miR-182 在肝臟以及心臟缺血再灌注方面有重要作用，而且最近發(fā)現(xiàn)miR-182 在腦缺血再灌注方面同樣發(fā)揮著積極的作用，但具體的分子機制尚不清楚[14-16]。

圖3 小膠質細胞轉染miR-182 后TLR4 的表達情況

圖4 小膠質細胞轉染siTLR4、TLR4 過表達質粒后TLR4 表達情況

圖5 小膠質細胞的炎癥因子表達水平

在本研究中，筆者首先證實在缺氧的情況下，miR-182 可以激活小膠質細胞，隨著OGD 的誘導，miR-182 的表達呈下降趨勢而TLR4 的表達呈上升趨勢，表明miR-182 與TLR4 可能有相互關系，而隨后的熒光素酶基因測定實驗證實TLR4 是miR-182的直接靶點。而后筆者通過過表達miR-182 發(fā)現(xiàn)TLR4 的表達下降，過表達TLR4 的開放閱讀框及miR-182 發(fā)現(xiàn)TLR4 的表達增強，說明miR-182 與TLR4 是一種負向的調節(jié)關系，miR-182 結合到TLR4 mRNA 上的3’UTR 來調節(jié)TLR4 的轉錄與翻譯過程。最后筆者通過過表達miR-182 后檢測促炎因子的表達，發(fā)現(xiàn)表達降低，同時過表達TLR4 的開放閱讀框及miR-182 時促炎因子水平并不降低，所以結果表明miR-182 下調TLR4 的轉錄與翻譯，從而減輕下游炎癥因子的表達。通過本研究結果可以發(fā)現(xiàn)，miR-182 可以調節(jié)TLR4 介導的炎癥反應，而作為腦組織特異表達的miRNAs 之一，其在腦疾病的炎癥反應中可以發(fā)揮重要作用。miRNAs 作為小分子物質可以更容易輸送到受損傷的腦組織中去，更加直接地結合到所需要的靶點上發(fā)揮作用。通過miRNAs 來降低特定疾病相關靶基因的蛋白水平是一種新的治療策略。

綜上所述，本研究確定了miR-182-TLR4 途徑的相互作用，其部分地解釋了小膠質細胞介導的神經(jīng)炎癥的機制。研究結果暗示，miR-182 對腦缺血-再灌注損傷可能具有保護作用，這可能歸因于miR-182-TLR4 途徑的抑制和隨后的炎癥反應的減弱。此外，本研究數(shù)據(jù)表明miR-182 可能是治療腦缺血再灌注損傷的潛在候選分子，同時可能包括其他的缺血再灌注疾病治療。然而，miR-182 能否有效改善患者的臨床結果還需要進一步研究。