孟 駿,汪 芳,孫 璐,陳俊伸,沈新春

(南京財經大學食品科學與工程學院,現代糧食流通 與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,糧油質量安全控制及深加工重點實驗室,江蘇南京 210023)

長期以來,大豆一直是亞洲地區(qū)人們的主要副食,大豆制品如豆腐、豆?jié){、豆干等,食味鮮美,營養(yǎng)豐富,是東亞國家的傳統(tǒng)食品[1]。其中豆?jié){因為具有高蛋白,富含亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸等人體必需脂肪酸等優(yōu)點,更加受到消費者的青睞。

豆?jié){的風味特性受多種因素影響,不同大豆品種,種植環(huán)境,加工工藝都會影響豆?jié){的風味。傳統(tǒng)對于豆?jié){風味的分析多采用感官評價的方法[2],感官評價能較客觀地反映人類對于相關食品的味覺,嗅覺和視覺感受,但其存在重現性較差,個體差異大等缺點。而電子舌技術是20世紀80年代發(fā)展起來的一種分析、識別液體“味道”的新型檢測技術[3]。其優(yōu)點尤為突出:首先,待測樣品不需經過任何前處理,其次,檢測速度快,從樣品檢測開始到完成只需要花費幾十秒到幾分鐘的時間。同時,電子舌具有較高的靈敏度和重復性,測量結果可靠,從而避免了在感官評價中因為不同人群的主觀傾向性造成的誤差[4]。

豆?jié){的主要風味為甜味和苦味,據報道,豆?jié){中的苦味主要是由于大豆種子中的酚酸、異黃酮、皂苷以及脂肪氧化酶或不飽和脂肪酸的氧化酸敗引起[5-9]。豆?jié){的甜味除了和大豆中的糖類物質有關,也和大豆中的其他組分有密切的關系。氨基酸作為重要的呈味物質[10-11],廣泛存在于大豆種子中,有研究指出,氨基酸種類和含量影響著食品的風味[12-13]。而有關大豆蛋白質、氨基酸組成對豆?jié){甜味的研究鮮有報道,這將阻礙育種專家選育用于豆?jié){加工的專用大豆品種,因此,有必要從大豆原料的蛋白質、氨基酸組成層面上研究它與豆?jié){甜度之間的關系。

本文采用電子舌分析了豆?jié){的甜味屬性,并檢測了大豆原料中的蛋白質及氨基酸組成,通過相關性分析和回歸分析建立了基于大豆蛋白質和氨基酸組成的豆?jié){甜度預測模型,并期望通過此模型快速地預測未知大豆品種加工成豆?jié){的甜度,達到為豆?jié){生產篩選優(yōu)質的大豆種子,為豆?jié){加工的原料優(yōu)化提供理論依據的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗選取36種大豆原料 均由南京農業(yè)大學國家大豆改良中心提供，這些試驗品種種植于南京農業(yè)大學江浦試驗站,并于2015年秋收獲,從36種大豆原料中隨機選擇30種用于預測模型的構建,剩余的6種用于預測模型的驗證,具體品種名稱見表1；PBS緩沖液、樣品緩沖液、4%～15%變性蛋白梯度分離膠、考馬斯亮藍G-250染色液、電泳脫色液、截留分子量3500 Da透析袋、11～180 kDa蛋白Marker 北京索萊寶科技有限公司;石油醚、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、無水硫酸銅、硫酸鉀等 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

表1 36個大豆品種Table 1 36 soybean varieties

高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;SL-N電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;AD-G858攪拌機 深圳正向電器實業(yè)有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;K-360全自動凱氏定氮儀 瑞士Buchi公司;L-8900全自動氨基酸分析儀 中國天美科學儀器有限公司;小型垂直電泳儀 美國Bio-Rad公司;凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;ASTREE電子舌 法國Alpha MOS公司;THZ-C恒溫振蕩器 太倉市實驗設備廠;H1850R離心機 湖南湘儀儀器有限公司;ALPHA 1-4/2-4 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆蛋白質及氨基酸含量的測定 蛋白質含量測定參照GB 5009.5-2016進行測定[14];水溶性蛋白含量的測定參照NY/T 1205-2006進行測定[15];氨基酸含量參照GB 5009.124-2016,使用氨基酸自動分析儀進行測定[16]。

1.2.2 大豆蛋白亞基組成分析

1.2.2.1 脫脂豆粉的制備 將不同品種的大豆種子經粉碎機粉碎后過80目篩,所得的豆粉與石油醚按照1∶8的比例(質量體積比)在具塞錐形瓶中混合,放入恒溫振蕩器中以25 ℃的條件振蕩8 h,靜置1 h待混合液分層后棄去上清液,保留豆粉;重復加入石油醚,25 ℃振蕩8 h,靜置1 h后棄去上清液3次,最后將剩余脫脂豆粉風干,即得到脫脂豆粉,-20 ℃保存。

1.2.2.2 大豆分離蛋白的提取 參考李淑芬等[17]的方法,提取大豆分離蛋白,具體操作為:將脫脂大豆粉與蒸餾水按1∶10的比例(質量體積比)混合,用1 mol/L NaOH溶液調pH至8.0,40 ℃恒溫攪拌30 min,將懸浮液在4 ℃,3100×g條件下離心20 min,取上清液用1 mol/L HCl溶液調pH至4.5,將懸浮液在4 ℃,3100×g條件下離心20 min,取沉淀復溶于蒸餾水中,用1 mol/L NaOH溶液調pH至7.0,透析24 h,冷凍干燥后得大豆分離蛋白。

1.2.2.3 SDS-PAGE分析 將大豆分離蛋白與1 mol/L PBS溶液配制成濃度為2 mg/mL的溶液,并按4∶1的比例與樣品緩沖液混合(樣品緩沖液包含12.5% Tris-HCl,5%巰基乙醇,10% SDS,50%甘油,0.5%溴酚藍),90～95 ℃水浴加熱5 min,冷卻至室溫后將5.0 μL溶液加載到4%～15%的梯度分離膠中,在120 V的電壓下進行SDS-PAGE直到溴酚藍指示劑遷移到凝膠的底部邊緣[18]。電泳結束后,使用考馬斯亮藍G-250(0.1%)染色,然后在脫色液中(10%甲醇,10%乙酸)脫色直到條帶清晰。采用Image LabTMAnalysis Software軟件對11S(大豆球蛋白)、7S(β-伴大豆球蛋白)以及相應亞基(α′亞基、α亞基、β亞基、A3亞基、酸性亞基組AS、堿性亞基組BS)的含量進行定量分析。

1.2.3 豆?jié){的制備 采用傳統(tǒng)的豆?jié){加工方法[19],將100 g大豆種子在室溫下漂洗,并在300 mL蒸餾水中浸泡10 h,將浸泡過的大豆種子瀝干,以8倍大豆質量的水進行磨漿,所得豆?jié){經過150目篩過濾后,加熱至沸騰并保持5 min,即得試驗所用鮮豆?jié){。

1.2.4 豆?jié){甜味電子舌分析 將20 mL不同品種大豆制成的鮮豆?jié){轉移至電子舌專用樣品燒杯中,樣品與校準溶液(超純水)交替檢測。甜味的檢測方法采用標準添加的方法,具體操作為:選取5份20 mL同一品種大豆種子所制成的鮮豆?jié){,依次向每份鮮豆?jié){中加入0.0、0.4、1.0、2.0、4.0 mg標準葡萄糖,使每份鮮豆?jié){中的標準葡萄糖濃度分別為0.00、0.02、0.05、0.10、0.20 mg/mL,將5份添加有不同濃度葡萄糖的鮮豆?jié){選擇為標準添加物(Standard addition products),與其他不添加葡萄糖的鮮豆?jié){樣品共同進行味覺分析。各樣品平行測定6次,選取較穩(wěn)定的后3次測定數據進行分析。

1.2.5 豆?jié){甜度預測模型的建立 利用SPSS 22.0軟件,采用回歸分析的方法將豆?jié){甜度值與大豆種子蛋白質及氨基酸含量進行關聯分析。首先將36個用于建立豆?jié){甜度預測模型的樣品分為兩組,第一組隨機選取30種樣品(總樣本數的83%)用于構建豆?jié){甜度預測模型,第二組將剩余的6種樣品(總樣本數的17%)作為驗證模型可靠性的測試樣品集。利用建立的模型對6個測試樣本集進行預測,比較預測值和真實值(電子舌測定的豆?jié){甜味數值)之間的差異,以此來驗證模型的可靠性。

1.3 數據處理

每項實驗均設計進行3組平行。實驗數據通過SPSS 22.0軟件和Origin9.1軟件進行分析,通過單因素方差分析評估差異的顯著性。以p<0.05作為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同品種大豆蛋白組成及豆?jié){甜度分析

豆?jié){的主要成分是大豆蛋白,大豆蛋白主要由大豆球蛋白(11S)和β-伴大豆球蛋白(7S)組成。這兩種類型蛋白質組分占總蛋白質的70%以上[1],11S為六聚體形式,由通過二硫鍵連接在一起的酸性亞基組(AS)和堿性亞基組(BS)組成[20]。7S主要成分包括三個通過疏水相互作用和氫鍵連接的亞基α′,α和β[1]。本實驗隨機選擇的30個不同品種大豆,其蛋白質含量、蛋白亞基組成及含量、水溶性蛋白含量及其豆?jié){制品甜度測定結果見圖1、表2。

圖1 36個品種大豆的蛋白亞基的電泳圖Fig.1 Electrophoresis of protein subunits in 36 soybean varieties

表2 30種不同品種大豆原料蛋白質組成及其豆?jié){甜度分析Table 2 Analysis of protein composition and the sweetness value in soymilk produced from 30 soybean varieties

圖1為模型構建組及驗證組共36個大豆品種的蛋白亞基圖譜,由圖1可知,不同品種大豆原料的蛋白亞基組成種類基本相同,而相同蛋白亞基的組成含量卻存在很大差異,不同的貯藏蛋白組成將會導致大豆蛋白具有不同的功能特性。

表2則顯示了模型構建組中30個大豆原料蛋白質及其亞基的含量組成,以及采用這30種大豆原料所制備的豆?jié){甜度。從表2中可以看出,本實驗隨機選擇的30種大豆品種,其蛋白質含量,11S、7S含量及亞基組成、11S/7S比例之間存在著廣泛變異。除了水溶性蛋白含量之間差異不顯著(變異系數6.87%),其余指標的變異系數均大于10%,表明本實驗所選取的實驗品種之間具有豐富的遺傳多樣性。不同品種間蛋白質組成亞基種類基本相同,而各個亞基之間含量差異較大,尤其是7S中的α′、α、β亞基,變異系數均大于25%,這說明不同大豆種子中7S亞基的組成差異十分顯著。而7S含量的變異系數為20.88%,11S含量的變異系數為10.01%,表明在大豆種子的貯藏蛋白中,11S的穩(wěn)定性高于7S的穩(wěn)定性。這和周宇峰等[21]、黃明偉等[22]關于大豆品種間蛋白亞基含量差異性的研究結果一致。

通過對不同品種大豆制得的豆?jié){進行電子舌分析后發(fā)現,不同品種大豆所制備的豆?jié){甜度測試平均值為6.48,而測試值從2.60變化到了8.79,變異系數為25.95%,不同品種大豆在制得豆?jié){的甜度屬性方面存在著明顯差異。以上結果說明,不同品種大豆因為其化學組分及組分含量不同,從而導致不同品種大豆制作的豆?jié){在甜度指標方面上有很大差異。

2.2 不同品種大豆氨基酸組成分析

表3顯示了30種大豆品種的氨基酸組成,可以看出,大豆種子中天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸的含量高于其他種類氨基酸。不同大豆品種間,所有氨基酸種類的變異系數均大于10%,而絲氨酸、甘氨酸的變異系數達到了40%以上,這表明,不同品種大豆種子中氨基酸含量的分布差異較大,絲氨酸、甘氨酸含量的差異最為明顯。

表3 30種不同品種大豆原料氨基酸組成分析Table 3 Analysis of amino acid composition in 30 soybean varieties

2.3 大豆蛋白、氨基酸含量與豆?jié){甜度相關性分析

豆?jié){甜度值在很大層面上影響著豆?jié){的整體食用品質,甜味較濃厚的豆?jié){更易于被廣大消費者所接受[18]。豆?jié){甜味與大豆蛋白組分、氨基酸組分的相關性分析結果見表4。

表4 豆?jié){甜度值與大豆蛋白及氨基酸含量的相關系數和回歸系數Table 4 Correlation coefficient and regression coefficient in soymilk sweetness value with protein and amino acid contents of soybean materials

本實驗統(tǒng)計了大豆蛋白組分、氨基酸組分共27個指標與豆?jié){甜度的相關性,其中α亞基含量、11S含量、7S含量、11S/7S比例、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、酪氨酸等8個指標與豆?jié){甜度顯著相關(p<0.05)。在大豆的蛋白組成方面,并沒有發(fā)現大豆蛋白質含量、水溶性蛋白含量和豆?jié){甜味間顯著的相關性(p>0.05),而在蛋白亞基組成層面,α亞基含量(r=-0.460,p=0.011)、7S含量(r=-0.428,p=0.018)與豆?jié){甜度呈顯著負相關(p<0.05),而11S含量(r=0.370,p=0.044)、11S/7S比例(r=0.436,p=0.016)則與豆?jié){的甜度值呈顯著正相關關系(p<0.05)。這表明,在大豆的主要貯藏蛋白中,11S含量的增加將更有利于豆?jié){的甜度,這可能是由于11S中含硫氨基酸比較豐富,更有利于豆?jié){的整體甜味,相比于11S含量,7S含量增加則不利于豆?jié){的甜度。在氨基酸組成方面,蘇氨酸(r=0.373,p=0.042)、絲氨酸(r=0.418,p=0.021)與豆?jié){甜味呈現顯著正相關(p<0.05),蛋氨酸(r=-0.372,p=0.043)、酪氨酸(r=-0.464,p=0.010)與豆?jié){甜味之間呈顯著負相關關系(p<0.05)。

2.4 豆?jié){甜度預測模型

2.4.1 豆?jié){甜度預測模型的構建 逐步回歸是一種多元線性回歸方法,可以選擇具有最佳擬合度的自變量組合來進行因變量的預測[23],首先,逐步回歸過程定義了整體模型,之后向先前模型中添加或刪除變量。然后通過臨界p值驗證添加或刪除變量的合格性,從而達到最優(yōu)的預測效果。本研究以α亞基、11S總量、7S總量、11S/7S比例、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、酪氨酸等8個與豆?jié){甜度顯著相關的大豆品質指標為自變量,以豆?jié){的甜度值為因變量,通過逐步回歸的方法建立了豆?jié){甜度預測模型,如圖2所示。

圖2 豆?jié){甜度值預測模型Fig.2 Predictive model of soymilk sweetness value注:圖中樣品編號與表1相同。

由圖2可知,逐步回歸過程中對原本的8個自變量進行了選擇優(yōu)化,分析了每種自變量組合對豆?jié){甜度的預測效果,最終發(fā)現用α亞基、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、酪氨酸等五種指標建立的豆?jié){甜度預測模型具有最佳的預測效果,其模型的決定系數R2=0.747。

預測方程為:F(甜度預測值)=-0.125×α亞基+3.172×蘇氨酸+1.655×絲氨酸-2.894×蛋氨酸-2.097×酪氨酸+9.908

式(1)

從模型的權重系數可以看出,在有利于豆?jié){甜度的指標中,相較于絲氨酸,蘇氨酸含量對豆?jié){甜度的影響更加顯著(p<0.05),而在不利于豆?jié){甜度的指標中,蛋氨酸比酪氨酸發(fā)揮著更加突出的作用。這與趙靜等[10]有關豬骨湯中游離氨基酸呈味特性的研究結果相近,在其研究中指出,蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸和丙氨酸對豬骨湯的甜味有突出貢獻,酪氨酸、亮氨酸、蛋氨酸則會使豬骨湯呈現苦味。而本研究的結果顯示,絲氨酸和蘇氨酸有利于豆?jié){的甜度值,而酪氨酸和蛋氨酸則不利于豆?jié){的甜度值。整體而言,具有高含量絲氨酸、蘇氨酸以及低含量α亞基、蛋氨酸、酪氨酸的大豆種子將更加適合生產甜味濃郁的豆?jié){。

2.4.2 豆?jié){甜度預測模型的驗證 為了驗證豆?jié){甜度預測模型的精確性,本研究測定了模型驗證組中6個大豆品種(編號V1～V6)的甜度值,以及α亞基、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、酪氨酸的含量,并將測定的5種指標數值帶入公式1,計算出模型驗證組6種樣品的豆?jié){甜度預測值,并將豆?jié){甜度預測值與電子舌測定的甜度值相比較,結果見表5。

表5 模型驗證組中豆?jié){甜度的實測值與預測值的誤差分析Table 5 Relative error analysis between actual and predicted values of soymilk sweetness in model verification group

由表5可知,通過逐步回歸建立的豆?jié){甜度預測模型,可以較為準確地預測豆?jié){甜度,通過公式1計算出模型驗證組中6個樣品的豆?jié){甜度預測值,并與電子舌測得的豆?jié){實際甜度值相比較,其相對誤差均小于10%。其中,V1、V2、V3、V6的相對誤差均小于5%,6個驗證樣品的平均相對誤差為4.61%,這些結果表明了本研究建立的豆?jié){甜度預測模型對豆?jié){實際甜度有良好的預測功能,可以作為豆?jié){甜度預測的一種有效方法。

3 結論

本文研究了30種大豆原料蛋白質,氨基酸組成及其所制作豆?jié){的甜度值。不同大豆品種的各項品質指標和豆?jié){的甜度值均有較大差異。對于豆?jié){的甜度,11S、11S/7S、絲氨酸、蘇氨酸含量與豆?jié){的甜度呈顯著正相關,α亞基、7S、蛋氨酸、酪氨酸含量與豆?jié){的甜度呈顯著負相關。通過逐步回歸建立的豆?jié){甜度預測模型具有良好的預測能力,模型的決定系數R2=0.747,預測結果的平均相對誤差為4.61%,該模型可以作為豆?jié){甜度預測的一種有效方法。此方法方便快捷,無需原料加工和儀器分析,便可預測未知大豆品種所加工的豆?jié){甜度。因此,該方法可以廣泛應用于豆?jié){生產,具有較高的實際應用價值。