蘇詠梅，朱文進(jìn)，周 曉，張同玉，李祥龍，吳建華

（河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北秦皇島 066600）

毛色是家畜品種的主要特征，是識(shí)別家畜品種和個(gè)體的重要依據(jù)和主要標(biāo)志，毛色做為家畜生物學(xué)性狀其經(jīng)濟(jì)價(jià)值在不同家畜及其類型中差異很大[1]。中國(guó)家驢的毛色沒有馬的復(fù)雜，但也多種多樣，且各地命名不一。中國(guó)家驢的毛色基本可分為單色毛和混合色毛兩大類，其中單色毛主要有純黑色和白色2 種，這類毛沒有雜色，且終生不變；混合色毛主要有粉黑色、皂角黑色、灰色、青色、蒼色、栗色、銀河毛和花毛等，這類毛色由不同毛色混雜或毛色隨年齡的增長(zhǎng)深淺有變化[2]。

驢是傳統(tǒng)的役用動(dòng)物，對(duì)其毛色的選育和研究較少[3-11]。ASIP 基因是家畜毛色性狀的主要候選基因之一。Abitbol 等[3]在對(duì)法國(guó)驢毛色的研究中發(fā)現(xiàn)，純黑色驢 ASIP 基因編碼區(qū)第3 外顯子有1 處隱性錯(cuò)義突變（c.349 T＞C），使該位點(diǎn)編碼的氨基酸發(fā)生變異（由半胱氨酸變?yōu)榫彼幔?，進(jìn)而使黑色素合成累積，被毛呈黑色。驢ASIP 基因的錯(cuò)義突變（c.349 T＞C）可以形成CC 型、TC 型與TT 基因型，其中CC 基因型驢被毛為純黑色，TC 與TT 基因型驢被毛為非純黑色。為了解中國(guó)家驢毛色是否與ASIP 基因的該錯(cuò)義突變（c.349 T＞C）有關(guān)，本研究對(duì)中國(guó)家驢16 個(gè)品種 680 個(gè)體的ASIP 基因進(jìn)行分析，為中國(guó)家驢毛色性狀的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 實(shí)驗(yàn)用16 個(gè)驢品種血樣采自河北、山西、山東、內(nèi)蒙古、甘肅、陜西、新疆、寧夏、河南9個(gè)省的16 個(gè)地區(qū)，共計(jì)680 頭驢的血樣。驢的品種、數(shù)量、采樣地及其毛色特征見表1。血樣采自前腔靜脈，ACD 抗凝，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，分裝出3 mL 的一小份，4℃保存?zhèn)溆?，其余置?70℃凍存。

1.2 總基因組DNA 的提取與PCR 擴(kuò)增 總DNA 的提取采用常規(guī)酚-氯仿抽提法[12]，特異性引物是參考文獻(xiàn)[3]的序列，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，引物的上游序列為5'-GGCCTCCATAGTCCAAAGAGC-3'；下游序列為5'-TTGCAGAAGGGACCTCAGGGT-3'。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：2×Es Taq Master Mix 12.5 μL，上下游混合引物1.5 μL（10 pmol/μL），DNA 模板2 μL（10 ng/μL），去 離 子 水9 μL，2×Es Taq Master Mix購(gòu)自世紀(jì)康為公司（CWBIO）。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性6 min；94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸40 s，32 個(gè)循環(huán)；72℃修復(fù)延伸10 min。

PCR 產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將符合要求的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)酶切或直接送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序，PCR 產(chǎn)物膠純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 PCR-RLFP 分析 酶切體系為20 μL：10×NE Buffer 2 μL，限制性內(nèi)切酶Brs Ⅰ（10 U/μL，NEB 公司）0.4 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，dd H2O 7.6 μL。65℃酶切20 min，80℃失活20 min，冷卻后用2%的瓊脂糖凝膠電泳（電壓120 V 電泳1.5～2 h）。Bio-RAD 凝膠成像系統(tǒng)成像觀察酶切效果，并記錄分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)PCR-RLFP 分析結(jié)果，記錄所有樣品檢測(cè)位點(diǎn)基因型，根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]計(jì)算公式，采用Excel 計(jì)算、統(tǒng)計(jì)基因型和基因頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國(guó)家驢毛色特征 從表1 看出，中國(guó)家驢毛色以粉黑色、灰色和皂角黑色為主，另外還有少量純黑色、青色和栗色，蒼色、銀河色和白色很少見，在采樣過程中沒有見到花色驢。大型驢和中型驢的毛色以粉黑色為主，小型驢的毛色以灰色為主；皂角黑為過度毛色，在大、中和小型驢中均有分布，每個(gè)驢品種的毛色有5 種以上，盡管有些毛色在一些品種中很少，這說明中國(guó)家驢選育程度較低。

2.2 中國(guó)家驢ASIP 基因的變異位點(diǎn) 選擇有毛色性狀記錄個(gè)體的烏頭黑驢6 頭、粉黑驢6 頭、皂角黑6 頭灰色驢6 頭、青色驢 6 頭、栗色6 頭、蒼色5 頭、銀河4 頭和白驢 2 頭，共計(jì)47 頭，對(duì)其ASIP 基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序（圖1）表明，在中國(guó)家驢品種中存在ASIP 基因第3 外顯子 c.349 T＞C 的突變。

圖1 中國(guó)家驢ASIP 基因第3 外顯子的突變位點(diǎn)

表1 實(shí)驗(yàn)用驢種、數(shù)量、采樣地及毛色特征

2.3 中國(guó)家驢ASIP 基因的SNP 多態(tài)性 從圖2 可以看出，ASIP 基因的PCR 產(chǎn)物在340 bp 位置與目的片段一致，而且條帶清晰，特異性好；純黑色驢的基因型以CC 為主，其酶切帶型為340 bp 1 條帶，表明不能被BsrⅠ內(nèi)切酶切開；非純黑色驢的基因型為TT型或TC 型，未檢測(cè)到CC 基因型；TT 型純合子酶切帶型為209 bp 和131 bp 2 條，TC 型雜合子帶型為340、209、131 bp 3 條，均表明能被Bsr Ⅰ內(nèi)切酶切開。中國(guó)家驢ASIP 基因第3 外顯子PCR-RFLP 表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性。

在純黑色驢中，CC 基因型的檢出率為89.29%（25/28），純黑色德州驢、廣靈驢、渤海驢和慶陽(yáng)驢的基因型都是CC 型，檢出率100%，而純黑色晉南驢、陽(yáng)原驢和新疆驢各有1 個(gè)純黑色驢的個(gè)體不是CC 型。在非純黑色驢（包括粉黑、皂角黑、灰色、青色、蒼色、栗色、銀河毛和白色）中，TT 或TC 基因型檢出率為99.54%（677/680）。

圖2 驢ASIP 基因的PCR 產(chǎn)物酶切多態(tài)性

2.4 中國(guó)家驢ASIP 基因的基因型頻率與基因頻率 從表2 可以看出，中國(guó)驢CC 型的頻率很低（0.037），TT 型的頻率最高（0.731），C 等位基因的頻率很低（0.153），T 等位基因的頻率很高（0.847）。

3 討 論

關(guān)于家驢毛色調(diào)控的分子機(jī)制研究很少，主要集中在MC1R、ASIP、KTI 和STX17 等基因。Abitbol 等[3]選擇法國(guó)登記注冊(cè)的6 個(gè)品種127 頭驢進(jìn)行毛色對(duì)比試驗(yàn)，并將這127 頭驢按照毛色分為兩大類，即黑驢（9頭）和三粉驢（118 頭），發(fā)現(xiàn)黑驢的ASIP 基因上存在1 處隱性錯(cuò)義突變（c.349T＞C），導(dǎo)致編碼區(qū)第117 位氨基酸由半胱氨酸突變?yōu)榫彼?，從而影響黑色素的形成過程，最終產(chǎn)生黑色被毛。Sun 等[8]和李詩(shī)穎[11]研究了中國(guó)13 個(gè)家驢品種590 個(gè)體ASIP 基因多態(tài)性與家驢毛色的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)中國(guó)家驢ASIP 基因同樣存在突變位點(diǎn)c.349T＞C，與Abitbol 等[3]研究結(jié)果一致，且突變位點(diǎn)c.349T＞C 可以將中國(guó)驢分為純黑色驢（CC 型）和非黑色驢（TT 型或TC 型）。本研究同樣證明，中國(guó)家驢ASIP 基因存在突變位點(diǎn)c.349T＞C，但與Abitbol 等[3]和Sun 等[8]研究不同的是在28 個(gè)純黑色被檢驢中有3個(gè)體不屬于CC 基因型。非純黑色驢中沒有檢測(cè)出CC基因型，只檢測(cè)出TT 和TC 基因型，且TT 或TC 基因型的分布在不同品種和不同毛色中沒有規(guī)律性，這與Sun 等[8]和李詩(shī)穎[11]的研究結(jié)果一致。

表2 中國(guó)16 個(gè)地方驢品種ASIP 基因的基因型頻率與基因頻率

在中國(guó)家驢品種中，純黑色的個(gè)體較少，主要分布在德州驢及其周邊驢種——渤海驢中。純黑色驢在德州驢中占樣本量的15.39%，渤海驢占14.82%。這與李詩(shī)穎[11]報(bào)道的德州驢純黑色個(gè)體占樣本量的比例為48.89%出入較大，這可能與采樣對(duì)象或目的不同有關(guān)，本研究樣品采自山東寧津的自然群體，而李詩(shī)穎[11]采自山東德州、東阿集團(tuán)養(yǎng)殖場(chǎng)的驢群，可能經(jīng)過有目的的選擇或是為了專門研究純黑色驢而采集純黑色驢較多。Abitbol 等[3]發(fā)現(xiàn)，影響家驢毛色的ASIP 基因從三粉驢到黑色驢為隱性遺傳，這解釋了家驢中純黑色個(gè)體少的原因。

純黑色德州驢體型偏重，動(dòng)作較遲鈍，為中國(guó)驢種中的“重型驢”[14]；另外，德州驢皮是熬制阿膠的道地藥材，特別是其中的純黑色驢皮，被認(rèn)為是極品阿膠的原料[15]，這也可能是德州驢中純黑色驢多的原因。本研究中純黑色驢個(gè)體基因型全部是CC 型。由此可見，利用ASIP 基因第3 外顯子PCR-RFLP 標(biāo)記對(duì)培育純黑色的肉皮兼用的驢新品系或品種具有重要的指導(dǎo)意義。

4 結(jié) 論

中國(guó)家驢ASIP 基因第3 外顯子存在c.349 T＞C 突變，PCR-RFLP 標(biāo)記可以區(qū)分中國(guó)家驢純黑色與非純黑色，可以作為純黑色家驢選育的分子標(biāo)記。