李 錦，朱風(fēng)華，陳 甫，朱連勤

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109）

乳酸菌是應(yīng)用最早、最廣泛的益生菌，是一類可利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌總稱。乳酸菌具有益生菌的效用，如維持動物胃腸道菌群平衡、提高機(jī)體免疫水平、促進(jìn)動物生長和改善腸道環(huán)境，具有良好應(yīng)用價值。Missotten 等[1]用植物乳桿菌飼喂1 日齡肉雞，飼料利用率明顯提高。付麗[2]將添加乳酸菌的飼料飼喂艾拔益加（AA）肉仔雞，肉雞免疫器官指數(shù)、血清雞新城疫抗體（NDV-Ab）效價、血清IgA 含量均有顯著提高。張曉羊等[3]報道，與飼喂6%棉粕的基礎(chǔ)飼料相比，飼喂含6%嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕的試驗(yàn)飼料蛋雞組的脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)和血白細(xì)胞介素-2（IL-2）含量均顯著提高，脾臟中白細(xì)胞介素-10（IL-10）mRNA表達(dá)量極顯著提高。孫偉[4]研究發(fā)現(xiàn)，用乳酸菌發(fā)酵飼料置換蛋雞配合飼料可提高血清禽流感病毒H9 亞型（AIV H9N1）和NDV-Ab 水平。大部分研究表明乳酸菌可以增強(qiáng)家禽免疫功能，但乳酸菌發(fā)酵飼料是否是通過作用SPF 雛雞信號通路來提高雛雞免疫功能，尚少見報道。因此，本研究以SPF 雛雞為試驗(yàn)對象，通過研究乳酸菌發(fā)酵飼料和PI3K 阻斷劑對其體液免疫、細(xì)胞免疫功能以及脾臟組織中PI3K、Akt mRNA 基因表達(dá)量和PI3K、Akt 蛋白表達(dá)量的影響，探討乳酸菌發(fā)酵飼料提高SPF 雞免疫功能與SPF 雞PI3K/Akt 信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計 選取14 日齡SPF 雛雞120 羽，隨機(jī)分為4 組，每組5 個重復(fù)，每個重復(fù)6 羽。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，發(fā)酵飼料組飼喂乳酸菌發(fā)酵飼料，基礎(chǔ)阻斷劑組為基礎(chǔ)飼料+PI3K 阻斷劑，乳酸菌阻斷劑組為發(fā)酵飼料+PI3K 阻斷劑?；A(chǔ)阻斷劑組、乳酸菌阻斷劑組受試雞每天每羽灌服1 mL 阻斷劑LY294002（含阻斷劑0.7 mg），連續(xù)灌服21 d。對照組、發(fā)酵飼料組于相同時間灌服相同劑量的生理鹽水。試驗(yàn)期21 d。雛雞自由飲食，按正常免疫程序進(jìn)行免疫接種。

1.2 基礎(chǔ)飼料與發(fā)酵飼料 乳酸菌發(fā)酵飼料制作參照王赫等[5]方法?；A(chǔ)飼料和發(fā)酵飼料組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼料和發(fā)酵飼料組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 試驗(yàn)材料 LY294002（HY-10108）購自Med Chem Express（Monmouth Junction，NJ，USA)；植物乳桿菌（20765）、嗜酸乳桿菌（6006）均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；Akt 抗體（ab106693）購自Abcam中國；PI3K 抗體（bs-2067R）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；磷酸化Akt（Phospho-Akt）（Ser473）抗體（AA329）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG（A0216）、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（A0208）均購自碧云天生物技術(shù)；MMT 試劑盒購自美國 Sigma 公司；NDV-Ab、IgA、IgM、IgG、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6 ELISA 試劑盒購自上海潤裕生物科技有限公司。

1.4 主要儀器設(shè)備 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；MK3 型酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；低溫超速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Gel Doc 1000 凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國ABI 公司）；Step One plus 型熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；紫外可見分光光度計（日本Bio Spes-nano 公司）；Tanon 4200 全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.5 檢測指標(biāo)與方法

1.5.1 生長性能 于試驗(yàn)第1 天和21 天稱體重、稱飼料，以重復(fù)為單位計算雛雞試驗(yàn)期間的平均日增重（ADG）、耗料增重比（F/G）和平均日采食量（ADFI）。

1.5.2 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 于試驗(yàn)第21 天從各組每個重復(fù)中各隨機(jī)取1 羽雞，進(jìn)行無菌翅靜脈采集抗凝血，刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）刺激淋巴細(xì)胞增殖，方法及條件優(yōu)化參照馮焱等[6]，于570 nm處測定OD 值，測得T、B 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。

1.5.3 抗體與細(xì)胞因子 于試驗(yàn)第21 天各組每個重復(fù)中各隨機(jī)取1 羽雞，心臟無菌采集血液，4℃靜置1 h，3 000 r/min 離心15 min，分離血清，-20℃保存。用酶聯(lián)免疫吸附法測定雛雞血清中NDV-Ab、IgA、IgM、IgG、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6 含量。

1.5.4 PI3K、Akt mRNA 表達(dá)量的測定 取15～20 mg脾臟，用碧云天生物技術(shù)RNAeasyTM動物RNA 抽提試劑盒（離心柱式）提取組織總RNA。紫外可見分光光度計測定總RNA 濃度及純度，所有樣品OD 比值（OD260nm/OD280nm)在1.8～2.0，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 完整性，-80℃保存。

使用碧云天生物技術(shù)BeyoRTTMⅡcDNA 合成試劑盒（with gDNA Eraser）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，所得cDNA 于-20℃保存或直接用于實(shí)時熒光定量PCR 檢測。

實(shí)時熒光定量PCR 檢測目的基因表達(dá)情況，使用碧云天生物技術(shù)BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix（2X）試劑盒檢測PI3K、Akt mRNA 的表達(dá)量，并用實(shí)時熒光定量PCR 儀測定。根據(jù)GenBank 上公布的雞PI3K、Akt 基因的保守核苷酸序列，用Primer 設(shè)計并合成3 對特異性引物（表2），以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，以β-肌動蛋白（β-actin）表達(dá)量為參比，用2-△△CT法計算目的基因相對表達(dá)量。

表2 引物序列

1.5.5 PI3K、Akt 蛋白表達(dá)量

1.5.5.1 組織處理把脾臟組織剪成細(xì)小的碎片，融解RIPA 裂解液，混勻，取適量裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1 mmol/LPMSF，1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑制成混合液后置冰上，按RIPA 裂解液說明書處理，用玻璃勻漿器勻漿，提取總蛋白，取適量樣品采用BCA 試劑盒測樣品總蛋白濃度，剩余樣品冷凍備用。

1.5.5.2 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測 分別向每種樣品添加SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5X），95℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性，調(diào)整上樣量為30 μg 進(jìn)行電泳，濃縮膠（80 V，20 min），分離膠（120 V，40 min）。將PVDF 膜在浸活液中浸活1 min，蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上（200 mA，4℃轉(zhuǎn)膜60 min），轉(zhuǎn)移后，取出PVDF 膜，用Tris-Hcl 緩沖液（TBST）漂洗3 次，每次5 min。封閉液封閉10 min，取出PVDF膜后用TBST 漂洗3 次，每次5 min。將其與1X 磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋的1 000 倍的1 抗結(jié)合，在搖床上4℃過夜孵育，取出PVDF 膜后用TBST 漂洗3 次，每次5 min。后與1X PBS 稀釋3 000 倍的第2 抗體結(jié)合，在搖床上孵育2 h，再次用TBST 漂洗3 次，每次5 min。用超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，2 min 后置于熒光成像儀檢測（Tanon 4 200）。用天能GIS 1D 分析軟件分析。

1.6 統(tǒng)計分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22 軟件單因素方差（One-Way ANOVA）程序進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著性采用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 時表示差異性顯著，P＜0.01 表示差異性極顯著，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 乳酸菌發(fā)酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞生長性能的影響 如表3 所示，ADG 和F/G 在4 組間均差異顯著，ADG 為發(fā)酵飼料組＞對照組＞乳酸菌阻斷劑組＞基礎(chǔ)阻斷劑組（P＜0.05），F(xiàn)/G 為發(fā)酵飼料組＜對照組＜乳酸菌阻斷劑組＜基礎(chǔ)阻斷劑組（P＜0.05）。

表3 乳酸菌發(fā)酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞生長性能的影響

2.2 乳酸菌發(fā)酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞外周血淋巴細(xì)胞的影響 如表4 所示，發(fā)酵飼料組T、B 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于其余各組，對照組T、B 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于乳酸菌阻斷劑組，乳酸菌阻斷劑組T、B 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于基礎(chǔ)阻斷劑組。

表4 乳酸菌發(fā)酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響 %

2.3 乳酸菌發(fā)酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞血清細(xì)胞因子含量的影響 如表5 所示，IL-2、IL-6、IFN-α 水平在4 組間均為發(fā)酵飼料組＞對照組＞乳酸菌阻斷劑組＞基礎(chǔ)阻斷劑組（P＜0.05）。各組其他指標(biāo)無顯著差異。

表5 乳酸菌發(fā)酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞血清細(xì)胞因子含量的影響

2.4 乳酸菌發(fā)酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞免疫球蛋白含量的影響 如表6 所示，IgA、IgM、IgG、NDV-Ab含量在4 組間均為發(fā)酵飼料組＞對照組＞乳酸菌阻斷劑組＞基礎(chǔ)阻斷劑組（P＜0.05）。

2.5 乳酸菌發(fā)酵飼料對雛雞脾臟PI3K 蛋白和脾臟Akt蛋白表達(dá)的影響 如圖1、圖2 和表7 顯示，雛雞脾臟PI3K、Akt 蛋白表達(dá)量在4 組間差異顯著，均為發(fā)酵飼料組＞對照組＞乳酸菌阻斷劑組＞基礎(chǔ)阻斷劑組（P＜0.05）。

表6 乳酸菌發(fā)酵飼料和PI3K 阻斷劑對雛雞免疫球蛋白含量和新城疫抗體含量的影響

圖1 PI3K 蛋白電泳圖

圖2 Akt 蛋白電泳圖

表7 乳酸菌發(fā)酵飼料對雛雞脾臟PI3K、Akt 蛋白表達(dá)的影響

2.6 乳酸菌發(fā)酵飼料對雛雞脾臟PI3K、Akt mRNA 表達(dá)的影響 如表8 所示，雛雞脾臟PI3K、Akt mRNA表達(dá)量均為均為發(fā)酵飼料組＞對照組＞乳酸菌阻斷劑組＞基礎(chǔ)阻斷劑組（P＜0.05）。

表8 乳酸菌發(fā)酵飼料對雛雞脾臟PI3K、Akt mRNA 表達(dá)的影響

2.7 部分變量間相關(guān)性分析 由表9 可知，PI3K mRNA表達(dá)量與ADG、T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、B 細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、IL-6、IFN-α、IgM、NDV-Ab 含量呈顯著正相關(guān)。Akt mRNA表達(dá)量與ADG、IFN-α 含量呈極顯著正相關(guān)，Akt mRNA 表達(dá)量與T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、B 細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、IL-6含量、IgM、NDV-Ab 含量呈顯著正相關(guān)。

3 討 論

3.1 乳酸菌發(fā)酵飼料對雛雞免疫功能影響 淋巴細(xì)胞是與動物體免疫活性極其相關(guān)的細(xì)胞，T 細(xì)胞反映機(jī)體細(xì)胞免疫活性，B 細(xì)胞反映機(jī)體體液免疫的活性。白細(xì)胞介素是可以由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生并作用于淋巴細(xì)胞的一類細(xì)胞因子，它們在傳遞信息、激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞、介導(dǎo)T 和B 細(xì)胞活化、增殖與分化方面有重要的作用。其中IL-2 被稱為T 細(xì)胞生長因子，它由T 細(xì)胞產(chǎn)生，同時又可以活化T 細(xì)胞來產(chǎn)生細(xì)胞因子。IL-6 可以由活化的T 細(xì)胞和B 細(xì)胞合成，能夠刺激活化B 細(xì)胞增殖，分泌抗體，刺激T 細(xì)胞增殖。尹艷軍等[7]研究發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)飼料分別添加1%和2%的乳酸凍干菌均能提高肉雞T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)免疫器官的生長發(fā)育。吳妍妍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，用嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕喂食AA 肉仔雞，與對照組相比，AA 肉仔雞血清中的IgA、IgM、IgG 均顯著提高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，乳酸菌發(fā)酵飼料提高了雛雞T、B 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，提高雛雞IL-2、IL-6、IFN-α 含量，顯著提高雛雞體內(nèi)免疫球蛋白IgA、IgM、IgG、NDVAb 含量，表明乳酸菌發(fā)酵飼料可提高雛雞體液免疫和細(xì)胞免疫功能。其可能機(jī)制為乳酸菌改善了雛雞腸道環(huán)境，增強(qiáng)了其對飼料的消化吸收能力，促生長能力明顯；乳酸菌通過與腸道內(nèi)其他菌群的生存競爭，減少和抑制了雛雞腸道內(nèi)的有害菌，使得雛雞抗菌抗病能力增強(qiáng)。

3.2 乳酸菌發(fā)酵飼料調(diào)控體液免疫和細(xì)胞免疫的機(jī)制PI3K/Akt 信號通路是一條經(jīng)典的信號通路，在細(xì)胞存活與分化、細(xì)胞生長、運(yùn)動和凋亡等多種生理和病理過程中起作用。近年來通過基因敲除、藥物干預(yù)及體外細(xì)胞研究等技術(shù)發(fā)現(xiàn)PI3K 參與T 細(xì)胞的發(fā)育、活化、增殖及分化，并且研究證明PI3K 信號在T 細(xì)胞發(fā)育的多個階段起重要作用[9]。T 細(xì)胞可能產(chǎn)生或者促進(jìn)產(chǎn)生一些細(xì)胞因子（如IL-2），它可以促進(jìn)B 細(xì)胞增殖和分泌抗體。張彤瑤[10]研究發(fā)現(xiàn)，金針菇菇腳通過激活PI3K/Akt 信號通路增強(qiáng)了肉雞免疫功能。本試驗(yàn)給雛雞飼喂基礎(chǔ)飼料或乳酸菌發(fā)酵飼料，在口服PI3K 阻斷劑時，均顯著降低雛雞PI3K、Akt mRNA 和蛋白的表達(dá)以及雛雞體液免疫和細(xì)胞免疫水平。通過變量間相關(guān)性分析結(jié)果可知，PI3K mRNA 表達(dá)量與雛雞平均日增重、T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、B 細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、IL-6、TFN-α、IgM、NDV-Ab 含量呈顯著正相關(guān)。Akt mRNA 表達(dá)量與日增重、IFN-α 含量呈極顯著正相關(guān)，Akt mRNA表達(dá)量與T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、B 細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、IL-6 含量、IgM、NDV 抗體含量呈顯著正相關(guān)。其可能機(jī)制為乳酸菌激活了PI3K/Akt 信號通路，刺激B、T 淋巴細(xì)胞的增殖，因此增強(qiáng)了動物體免疫功能。

表9 部分變量間相關(guān)性分析

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵飼料可以提高SPF雞體液免疫和細(xì)胞免疫功能，主要是通過激活SPF 雞PI3K/Akt 信號通路來提高機(jī)體的免疫功能。