萬(wàn)如 王亞軍 安巍

摘要：通過(guò)DNA條形碼技術(shù)，以psbA-trnH基因?yàn)闂l形碼編碼序列對(duì)枸杞屬植物21份試驗(yàn)材料進(jìn)行鑒定分析，在分子水平上獲得鑒定枸杞屬植物的理論依據(jù)。采用Clustal X比對(duì)序列，用Mega 7.0計(jì)算遺傳變異距離并比較序列間的差異，基于K2P模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，psbA-trnH序列的遺傳距離范圍為0.000 0～0.009 2，平均遺傳距離為0.003 0，可以鑒別親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的枸杞屬品種，并且構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)將航天誘變種與普通栽培種分成了2大支，各分支內(nèi)部均具有較高的自展支持率，因此，psbA-trnH序列可以作為初步鑒定枸杞屬植物的DNA條形碼。

關(guān)鍵詞：枸杞屬;DNA條形碼;分子鑒定

中圖分類號(hào)： S567.1+90.24 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）01-0056-04

枸杞為茄科（Solanaceae）茄族（Solaneae Reichb.）枸杞亞族（Lyciinae Wettst）枸杞屬（Lycium L.）植物，是多年生落葉灌木[1]，其果實(shí)、根皮、葉均具有較高的藥用及保健價(jià)值。該屬約有80種，是一個(gè)世界分布屬[2]，國(guó)內(nèi)主要種植區(qū)域分布在寧夏、新疆、甘肅、青海等地[3]。由于各品種間常有相同的基原或近緣，其發(fā)育形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)及所含的化學(xué)成分具有高度的相似性[4]，因此傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒別方法已難以解決此問(wèn)題。

DNA條形碼（DNA barcoding）是利用1個(gè)或少數(shù)幾個(gè)DNA片段對(duì)目標(biāo)物種進(jìn)行識(shí)別和鑒定的一項(xiàng)新技術(shù)[5]，它具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高、鑒定快速等特點(diǎn)[6]，已成為現(xiàn)代生物分類學(xué)研究中引人關(guān)注的新方向和研究熱點(diǎn)。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)適合用于鑒定植物的DNA條形碼基因序列進(jìn)行了積極的探索與研究，發(fā)現(xiàn)psbA-trnH基因片段進(jìn)化速率快，能夠積累較多變異，從而能夠鑒別親緣關(guān)系很近的物種[7-10]，因此適宜作為鑒定植物的DNA條形碼。

本研究旨在對(duì)21份枸杞屬植物試驗(yàn)材料進(jìn)行psbA-trnH的序列測(cè)定，并通過(guò)序列比對(duì)、序列間差異分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，探索其在枸杞屬植物中的適用性，從而為物種鑒定和分類提供依據(jù)并奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采樣時(shí)間：2017年6月14日。采樣地點(diǎn)：寧夏銀川市（蘆花臺(tái)）枸杞國(guó)家林木種質(zhì)資源庫(kù)，地處銀川平原西部、賀蘭山東麓，地理位置為105°49′～106°18′E，38°08′～38°52′N，年平均蒸發(fā)量為1 583.2 mm，年平均太陽(yáng)輻射量為 146 kcal/cm2，全年平均日照時(shí)數(shù)超過(guò) 3 000 h，日照率為69%，光能資源豐富，年平均氣溫差為 32 ℃ 左右，無(wú)霜期較短，降水量較少，屬于中溫帶干旱型氣候。

采樣品種：在銀川市枸杞國(guó)家林木種質(zhì)資源庫(kù)采集21份枸杞屬植物新鮮葉片于5 mL凍存管中，保存于液氮中備用。樣品詳情見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

2017年6月19日至7月21日在寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞工程技術(shù)研究所功能基因分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行21份枸杞屬植物材料的基因提取及克隆工作。具體工作流程如下：

總DNA的提?。翰捎眯滦椭参锘蚪MDNA提取試劑盒（DNA secure Plant Kit）提取DNA。

PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)如下引物：P1，5′-GTTATGCATGAACG TAATGCTC-3′;P2，5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′，用以上引物對(duì)21個(gè)試驗(yàn)材料在Bio-Rad PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系（15 μL）：2×pfumix（pfumix指濃縮PCR擴(kuò)增預(yù)混合溶液）7.5 μL，P1和P2各0.5 μL，模板DNA 2 μL，最后加ddH2O 4.5 μL補(bǔ)足至 15 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，36個(gè)循環(huán);72 ℃保溫10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

切膠回收：采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行回收，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收檢測(cè)，將純化后的目標(biāo)DNA作為測(cè)序反應(yīng)的模板。

連接轉(zhuǎn)化：采用pLB零背景快速克隆試劑盒，將回收產(chǎn)物連接于T載體（pGEM-T），再轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)。

陽(yáng)性克隆的篩選及測(cè)序：采用藍(lán)白斑法篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行菌落PCR及電泳檢測(cè)。最后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3 序列統(tǒng)計(jì)分析方法

利用Clustal X進(jìn)行序列比對(duì)，用Mega 7.0計(jì)算目標(biāo)序列的堿基組成、序列間的堿基變異頻率和序列間的轉(zhuǎn)換顛換頻率及其比率。通過(guò)比較序列種內(nèi)和種間差異的分布，利用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，評(píng)價(jià)各序列的鑒定效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列測(cè)定結(jié)果

測(cè)得21份枸杞屬植物葉綠體psbA-trnH間隔序列共21條，在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST相似性檢索，均有較好的匹配程度，確認(rèn)為目標(biāo)序列，檢索比對(duì)結(jié)果表明測(cè)序結(jié)果可靠準(zhǔn)確。

2.2 序列信息分析

利用Mega 7.0軟件對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，21份枸杞屬植物材料的psbA-trnH間隔序列的長(zhǎng)度均在546～565 bp之間，其中，北方枸杞和河北枸杞的psbA-trnH序列最長(zhǎng)，達(dá)到565 bp，其次是黃果變、黑果枸杞、寧農(nóng)杞5號(hào)、昌吉枸杞及6個(gè)航天誘變種，長(zhǎng)度均為555 bp，寧杞1號(hào)至寧杞7號(hào)，寧農(nóng)杞9號(hào)及圓果枸杞序列長(zhǎng)度最短，為546 bp。21份枸杞屬植物材料的G+C含量也存在差異，變異范圍為30.3%～31.4%。為使試驗(yàn)結(jié)果更加清晰，加入外類群的分析，在NCBI上進(jìn)行枸杞屬植物psbA-trnH間隔序列的BLAST檢索，找到外類群美國(guó)枸杞的序列信息，長(zhǎng)度為 513 bp，G+C含量為29.9%（表2）。

2.3 序列比對(duì)分析

經(jīng)過(guò)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)21條序列之間不僅發(fā)生了轉(zhuǎn)換和顛換，而且存在堿基或片段缺失現(xiàn)象。除了北方枸杞與河北枸杞，其他19種枸杞屬植物均在185 bp處存在19個(gè)堿基的缺失，與7個(gè)航天誘變種、黑果枸杞、黃果變以及昌吉枸杞相比，其他11種枸杞均在496 bp處存在9個(gè)堿基的缺失。利用Mega 7.0軟件計(jì)算表明，在21種枸杞屬植物的psbA-trnH序列中，保守位點(diǎn)（C）為566個(gè)，變異位點(diǎn)（V）數(shù)量為8個(gè)，其中簡(jiǎn)約位點(diǎn)（Pi）4個(gè)，自裔位點(diǎn)（S）4個(gè)，其轉(zhuǎn)換/顛換值（R）為0.2。

2.4 遺傳距離分析

在21份試驗(yàn)材料psbA-trnH序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，借助Mega 7.0計(jì)算Kimura 2-parameter遺傳距離。結(jié)果表明，21種枸杞的遺傳距離為0.000 0～0.009 2 cM，其中遺傳距離最?。?.000 0 cM）的組合有4個(gè)，分別是河北枸杞與北方枸杞和圓果枸杞、黃果變與黑果枸杞、寧杞1號(hào)至寧杞7號(hào)與寧農(nóng)杞9號(hào)、7個(gè)航天誘變種，其親緣關(guān)系最為接近，而昌吉枸杞與北方枸杞、圓果枸杞、河北枸杞之間的遺傳距離最大（0.009 2 cM），親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，它們的平均遺傳距離為 0.003 0 cM（表3）。

2.5 枸杞屬M(fèi)P樹(shù)鑒定

根據(jù)21個(gè)枸杞品種的序列測(cè)定結(jié)果，采用最大簡(jiǎn)約數(shù)法（maximum parasimony，簡(jiǎn)稱MP）構(gòu)建MP系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，模型為Kimura 2-parameter，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性用1 000次重復(fù)的自展檢測(cè)（bootstrap analysis）來(lái)評(píng)估（圖1）。psbA-trnH條形碼序列的聚類圖分成了2大支，寧杞1號(hào)到寧杞7號(hào)、寧農(nóng)杞9號(hào)、圓果枸杞、北方枸杞、河北枸杞及外類群美國(guó)種聚為1大支，其中寧杞1號(hào)至7號(hào)與寧農(nóng)杞9號(hào)處于同一分支，親緣關(guān)系最近，圓果枸杞、北方枸杞與河北枸杞為同一支，親緣關(guān)系最近，外類群美國(guó)品種單獨(dú)為1支，與上述11個(gè)品種的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。航天誘變種與黃果變、黑果枸杞和昌吉枸杞聚為1大支，與其他品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其中7個(gè)航天誘變種聚為同一支，親緣關(guān)系最近，黃果變、黑果枸杞、昌吉枸杞聚為同一支，與上述7個(gè)品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論與討論

由于枸杞屬種質(zhì)資源較為豐富，起源馴化有多種途徑，栽培歷史悠久，屬內(nèi)種間雜交現(xiàn)象普遍[11]，且諸多地方品種無(wú)科學(xué)命名，導(dǎo)致品種資源類型多且名稱亂，因此鑒定評(píng)價(jià)枸杞屬種質(zhì)資源具有深刻的意義[12]。本研究中21份種質(zhì)材料屬于枸杞屬近緣種，在遺傳多樣性鑒定評(píng)價(jià)過(guò)程中，農(nóng)藝性狀易受環(huán)境和栽培技術(shù)的影響不易鑒別，細(xì)胞學(xué)性狀多態(tài)性不豐富，此外同工酶性狀有器官特異性且受生長(zhǎng)發(fā)育階段的影響，具有一定的局限性[13]。而分子標(biāo)記法的出現(xiàn)，為資源鑒定評(píng)價(jià)提供了新的方法[14-15]。本研究利用葉綠體間隔序列 psbA-trnH 的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出完整序列片段，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。經(jīng)分析得出21份枸杞屬種質(zhì)資源的psbA-trnH序列長(zhǎng)度范圍為546～565 bp，共有8個(gè)變異位點(diǎn)，雖然序列過(guò)于保守，但其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)將21份種質(zhì)材料分成2大類，普通栽培種與圓果枸杞、北方枸杞、河北枸杞聚成1支，航天誘變種與黑果枸杞、黃果變、昌吉枸杞聚為1支，且各分支內(nèi)部具有較高的自展支持率，表明依據(jù)psbA-trnH序列的差異可以鑒定親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的枸杞屬種質(zhì)，而親緣關(guān)系較近的種質(zhì)資源還需進(jìn)一步研究。

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