李勇鐵 鄒永紅 劉德伍

【摘要】 目的：分析腫瘤壞死因子α受體1（TNF-αR1）在增生性瘢痕組織中基因表達(dá)情況，為今后從基因方面治療增生性瘢痕提供依據(jù)。方法：選取48例增生性瘢痕組織患者為觀察組（其中瘢痕組織增生時(shí)間1～3、4～6、7～12個(gè)月及1年以上各12例），12例正常瘢痕組織患者為對(duì)照組，以RT-PCR法對(duì)瘢痕組織中TNF-αR1 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，比較各組TNF-αR1 mRNA水平差異。結(jié)果：對(duì)照組TNF-αR1 mRNA表達(dá)均高于觀察組不同時(shí)間點(diǎn)TNF-αR1 mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且1年以上組織TNF-αR1 mRNA表達(dá)量均高于1～3、4～6、7～12個(gè)月組織（P<0.05）。結(jié)論：增生性瘢痕組織中TNF-αR1 mRNA表達(dá)低于正常瘢痕組織，同時(shí)隨著時(shí)間增加增生性瘢痕中TNF-αR1 mRNA表達(dá)會(huì)顯著上升。

【關(guān)鍵詞】 瘢痕組織; 增生性; RT-PCR; 表達(dá); 腫瘤壞死因子α受體1

【Abstract】 Objective：To analyze the gene expression of tumor necrosis factor α receptor 1（TNF-αR1）in hypertrophic scar tissue，and to provide evidence for gene therapy of hypertrophic scar in the future.Method：48 patients with hypertrophic scar tissue were selected as observation group（the scar proliferation time at 1-3，4-6，7-12 months and over 1year were occurred in 12 cases respectively）and 12 patients with normal scar tissue as control group.The expression of TNF-αR1 mRNA in scar tissue was detected by RT-PCR.The differences in TNF-αR1 mRNA levels among groups were compared.Result：The expression of TNF-αR1 mRNA in control group were higher than those of observation group at different time points（P<0.05），and the expression of TNF-αR1 mRNA in tissues over one year was higher than those of tissues over 1-3，4-6，7-12 months（P<0.05）.Conclusion：The expression of TNF-αR1 mRNA in hypertrophic scar tissue was lower than that of normal scar tissue，at the same time，the expression of TNF-αR1 mRNA in hypertrophic scar increased significantly with time.

【Key words】 Scar tissue; Hyperplastic; RT-PCR; Expression; Tumor necrosis factor α receptor 1

First-authors address：Jian Central Hospital，Jian 343000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.17.041

增生性瘢痕是臨床一種皮膚創(chuàng)面病理改變，為局部創(chuàng)面修復(fù)中組織過(guò)度增生形成，主要表現(xiàn)為顏色轉(zhuǎn)變、痕突高低不平、質(zhì)地實(shí)韌等，多發(fā)于真皮創(chuàng)傷，但也會(huì)出現(xiàn)于手術(shù)切口、較深的創(chuàng)傷[1]。目前增生性瘢痕治療以手術(shù)為主，其只能起到縮小、改善的作用無(wú)法達(dá)到除去瘢痕效果，但隨著人們對(duì)美觀需求日益增加，如何有效治療增生性瘢痕得到臨床關(guān)注。近些年隨著臨床對(duì)增生性瘢痕研究深入，發(fā)現(xiàn)瘢痕過(guò)度形成中有多種細(xì)胞因子參與，而腫瘤壞死因子α（TNF-α）更在其中發(fā)揮重要作用，此因子由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，參與自身免疫、炎癥、休克等多種病理過(guò)程，不僅能殺傷腫瘤細(xì)胞，還能影響機(jī)體成纖維細(xì)胞分解、膠原合成[2-3]。而TNF-αR1作為T(mén)NF-α的受體1，其數(shù)目的多少，則將直接影響TNF-α的敏感性，即當(dāng)TNF-αR1數(shù)目較多時(shí)，TNF-α就可更好地通過(guò)與TNF-αR1的結(jié)合而增加膠原酶和蛋白多糖酶的合成。Peruccio等[4]發(fā)現(xiàn)在增生性與正常瘢痕組織中TNF-α浸潤(rùn)細(xì)胞有明顯差異，增生性組織陽(yáng)性率低于正常組織，但其未就TNF-α基因動(dòng)態(tài)表達(dá)、作用機(jī)制等進(jìn)一步闡述。故本文通過(guò)觀察正常及不同增生瘢痕組織中TNF-αR1基因表達(dá)情況，分析其在增生瘢痕形成、發(fā)展的意義，旨在為今后增生性瘢痕治療提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取筆者所在醫(yī)院2017年3月-2018年9月收治的增生性瘢痕組織患者48例為觀察組，正常瘢痕組織患者12例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者無(wú)言語(yǔ)、精神障礙;未合并惡性腫瘤、免疫性疾病;無(wú)外用瘢痕治療藥史;對(duì)照組組織顏色與正常皮膚相近，創(chuàng)面愈合時(shí)間3年以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者臨床資料不全，有長(zhǎng)期免疫調(diào)節(jié)劑服用史;組織存在紅腫、充血、潰爛情況。標(biāo)本獲取經(jīng)患者知情同意、簽署知情同意書(shū)，醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 方法

1.2.1 儀器、試劑 分光光度儀（型號(hào)：Ultrospec3000，美國(guó)Pharmacia Biotech），TNF-αR1、β-actin引物由中山大學(xué)安達(dá)基因股份有限公司合成，PCR基因擴(kuò)增檢測(cè)儀（型號(hào)：ABI75000，北京欣興強(qiáng)森生物科技有限公司），TD-2Y多功能離心機(jī)（中山市生科試劑儀器有限公司），RT-PCR試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司），TRIzol Reagent總RNA提取試劑盒（美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（WD0413C型，北京）。

1.2.2 方法 （1）總RNA提取：將正常、增生性瘢痕組織，放入研缽加液氮冷凍，即刻研磨成粉末，研磨期間注意不斷加液氮，然后室溫放置2～3 min，將研磨組織移入離心管中，加TRIzol充分振蕩，并靜置5 min以使組織、細(xì)胞裂解充分，后行離心處理（12 000 g，10 min）去除沉淀。加氯仿抽提3 min，行高速離心處理（12 000 g，15 min，4 ℃），吸取上清液，加異丙醇沉淀RNA，再行高速離心（12 000 g，30 s，4 ℃），棄除濾液，重洗沉淀，并再次離心處理（12 000 g，130 s），稍微干燥后加無(wú)RNA酶水溶解，以獲得總RNA。經(jīng)電泳鑒定，所有樣本D260/D280值在1.8以上，表明樣品無(wú)明顯蛋白污染，純度較高，后調(diào)整總RNA濃度為0.5 mg/μL。（2）引物設(shè)計(jì)、PCR循環(huán)數(shù)：應(yīng)用相關(guān)軟件設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)上下游引物時(shí)為避免RNA中污染基因DNA擴(kuò)增導(dǎo)致假陽(yáng)性，需要將其設(shè)計(jì)在不同外顯子上，本次以β-actin為內(nèi)源性內(nèi)參照。行定量PCR擴(kuò)增，TNF-αR1 mRNA共28個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物為210 bp，β-actin mRNA共26個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)540 bp。（3）PCR反應(yīng)：每個(gè)標(biāo)本取總RNA 2 mL，行RT-PCR反應(yīng)，按試劑盒操作，取定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，并以凝膠掃描成像分析儀行光密度掃描，以獲取電泳條帶的光密度，檢測(cè)正常、增生性瘢痕組織中TNF-αR1 mRNA表達(dá)的變化，以目的基因mRNA與內(nèi)參照β-actin mRNA比值表示。TNF-αR1引物上游：5CCATCTGCTGCACCAAGTGCCA-3;下游：5AATCCTGCGTGGCAGTTACACA-3。β-actin引物上游：5GTGGGGCGCCCCCAGCCA-3;下游：5CTCCTTATTGTCCACGATTTC-3。

1.3 觀察指標(biāo) 分析TNF-αR1 mRNA表達(dá)情況，比較不同增生時(shí)間組織中TNF-αR1 mRNA水平差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析;計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較 觀察組男10例、女38例，年齡19～48歲，平均（30.5±4.2）歲，組織增生時(shí)間：1～3個(gè)月12例、4～6個(gè)月12例、7～12個(gè)月12例、1年以上12例。對(duì)照組男3例、女9例，年齡20～49歲，平均（30.7±4.1）歲。兩組性別、年齡資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 瘢痕組織TNF-αR1 mRNA表達(dá) 從增生瘢痕1～3、4～6、7～12個(gè)月及1年以上至正常瘢痕組織，值從左至右依次降低（TNF-αR1 mRNA表達(dá)量呈上升狀態(tài)），見(jiàn)圖1。

2.3 各組TNF-αR1 mRNA表達(dá)比較 觀察組1～3、4～6、7～12個(gè)月及1年以上的TNF-αR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（0.53±0.13）、（0.78±0.15）、（0.96±0.19）、（1.27±0.43），對(duì)照組TNF-αR1?mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.58±0.47），對(duì)照組TNF-αR1 mRNA表達(dá)均高于觀察組不同時(shí)間點(diǎn)TNF-αR1 mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.558，P=0.000），且1年以上組織TNF-αR1 mRNA表達(dá)量均高于1～3、4～6、7～12個(gè)月組織（F=20.739，P=0.000）。

3 討論

人體受損皮膚通過(guò)新真皮、再上皮化形成來(lái)使創(chuàng)面愈合，其中新生真皮以肉芽組織填充為主，而肉芽組織為受損組織周?chē)Y(jié)締組織（成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管、肌成纖維細(xì)胞等）生成[5]。臨床發(fā)現(xiàn)在人體創(chuàng)面愈合過(guò)程中，不僅需要分子信號(hào)刺激相關(guān)細(xì)胞增殖，同時(shí)還要限制細(xì)胞增殖程度，避免過(guò)度修復(fù)造成不良影響，而一系列行為主要由程序性細(xì)胞凋亡控制[6]。而目前已知細(xì)胞凋亡除了受死亡受體Fas介導(dǎo)外，TNF-αR1也是一種可促細(xì)胞凋亡的死亡受體，臨床認(rèn)為其介導(dǎo)細(xì)胞凋亡在瘢痕形成過(guò)程發(fā)揮重要作用。同時(shí)已有研究證實(shí)抗TNF-α抗體陽(yáng)性細(xì)胞所占比例在增生性瘢痕生長(zhǎng)過(guò)程呈上升趨勢(shì)，其提示TNF-α可能在增生性瘢痕發(fā)展中起重要作用，但與正常瘢痕比較，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例仍降低，推測(cè)可能與存在多種TNF抑制物、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞功能性降低有關(guān)[7-9]。

本次研究采用RT-PCR法對(duì)瘢痕組織中TNF-αR1 mRNA表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，對(duì)照組TNF-αR1 mRNA表達(dá)均高于觀察組不同時(shí)間點(diǎn)TNF-αR1 mRNA表達(dá)（P<0.05），且1年以上組織TNF-αR1mRNA表達(dá)量均高于1～3、4～6、7～12個(gè)月組織（P<0.05）。本次對(duì)TNF-αR1基因表達(dá)采用RT-PCR檢測(cè)，其作為臨床新型檢測(cè)技術(shù)，自動(dòng)化高、特異性強(qiáng)，能夠?qū)⒒驒z測(cè)從定性轉(zhuǎn)化為定量，準(zhǔn)確度提高，同時(shí)本次計(jì)算TNF-αR1相對(duì)定量，能排除反應(yīng)體系中可能出現(xiàn)的一切影響因素，較絕對(duì)定量的結(jié)果科學(xué)性、準(zhǔn)確度高[10]。結(jié)果表明增生性瘢痕TNF-αR1基因轉(zhuǎn)錄水平低下，提示激活的T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞功能低下，是組織TNF-α蛋白質(zhì)水平降低的根本原因。且隨著增生瘢痕逐漸成熟，組織中TNF-αR1基因轉(zhuǎn)錄水平也隨之上升，表明在瘢痕成熟過(guò)程中激活的T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞功能會(huì)有增強(qiáng)，臨床認(rèn)為這可能與糖皮質(zhì)激素、腎上腺素等抑制T、巨噬功能物質(zhì)水平降低及INF-γ等含量緩慢降低有關(guān)[11-12]。

有研究表明TNF-α可雙向調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞，高濃度時(shí)可促纖維細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，而低濃度時(shí)能有效抑制細(xì)胞增殖，其雙向調(diào)節(jié)機(jī)制可能與TNF-αR1作用成纖維細(xì)胞時(shí)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不同有關(guān)[13]。早期有學(xué)者認(rèn)為低濃度TNF-α通過(guò)促聚胺多糖Ⅰ、Ⅲ型膠原合成來(lái)達(dá)到促成纖維細(xì)胞增殖的目的，但相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)表明，TNF-α可促成纖維細(xì)胞增殖主要是通過(guò)直接誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮作用[14]。文獻(xiàn)[15]顯示TNF-α可促人滑膜成纖維細(xì)胞增殖，來(lái)增加膠原酶合成，使膠原降解，而后期大量實(shí)驗(yàn)也證明了高濃度TNF-α能對(duì)成纖維細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，還會(huì)減少細(xì)胞外基質(zhì)合成，從而使組織中沉積減少，故而臨床推測(cè)TNF-α在高濃度時(shí)，TRADD介導(dǎo)信號(hào)傳遞致細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖目的，同時(shí)由于細(xì)胞減少，使細(xì)胞外基質(zhì)分泌、沉積減少，這有利于抑制增生性瘢痕形成[16-17]。本研究中增生性瘢痕隨增生時(shí)間的增加，TNF-αR1含量逐步增加，臨床認(rèn)為當(dāng)TNF-αR1含量處于低濃度時(shí)，會(huì)刺激機(jī)體內(nèi)細(xì)胞增殖，從而使膠原酶合成增加，加速瘢痕主要成分膠原降解，使增生性瘢痕逐漸向正常瘢痕轉(zhuǎn)變，故而TNF-αR1含量會(huì)增加[18]。因此筆者推測(cè)增生性瘢痕形成、發(fā)展可能與TNF-α基因逆轉(zhuǎn)錄水平降低有關(guān)，臨床在抑制、治療增生性瘢痕時(shí)可通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將TNF-αR1基因?qū)腭：鄢衫w維細(xì)胞中，從而提高靶細(xì)胞敏感性，促發(fā)揮TNF-α發(fā)揮治療作用，達(dá)到抑制增生性瘢痕形成的目的[19-20]。

綜上，增生性瘢痕組織中TNF-αR1 mRNA表達(dá)低于正常瘢痕組織，同時(shí)隨著時(shí)間增加增生性瘢痕中TNF-αR1 mRNA表達(dá)會(huì)顯著上升。

參考文獻(xiàn)

[1]劉達(dá)恩，黎洪棉，梁自乾，等.TNF-αR1 mRNA和Caspase-10 mRNA在增殖期增生性瘢痕組織中的表達(dá)及意義[J].廣西醫(yī)學(xué)，2010，32（1）：4-7.

[2]楊景山.醫(yī)學(xué)細(xì)胞化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1990：6-16.

[3]章建林，林子豪，江華，等.增生性瘢痕組織中腫瘤壞死因子αR1mRNA的表達(dá)及意義[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2004，8（17）：3296-3297，3438.

[4] Peruccio D，Castagnolic C，Stella M，et al.Altered biosynthesis of tumor necrosis factor（TNF）alpha is involved in postburn hypertrophic scars[J].Burns，1994，20（2）：118-121.

[5]章建林，林子豪，江華，等.增生性瘢痕組織中TNF-α mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)及臨床意義[J].中華整形外科雜志，2004，20（1）：56-58.

[6]章建林，林子豪，江華，等.增生性瘢痕組織中TNF-α基因的表達(dá)及其意義[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26（1）：48-50.

[7] Joyce D A，Steer J H，Abraham L J.Glucocorticoid modulation of human monocyte/macrophage function：control of TNF-alpha secretion[J].Inflamm Res，1997，46（11）：447-451.

[8]高春芳，徐玲玲，王皓，等.正常皮膚與瘢痕組織成纖維細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子、細(xì)胞外間質(zhì)和膠原基因啟動(dòng)子反應(yīng)性比較研究[J].中華皮膚科雜志，2003，36（11）：628-631.

[9] Duncan M R，Berman B.Differencial regulation of collagen，glycosaminoglycan，fibronection and collagenase activity production in cultured human adult dermal fibroblasts by interleukin1-α andβ and TNF-α and β[J].J Inest Dermatol，1989，92（5）：699-706.

[10]杜逸鳳，潘寧，吳冬梅.病理性瘢痕與多種細(xì)胞因子相關(guān)性的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2016，13（1）：141-144.

[11]章建林，林子豪，江華，等.TNF-α及其受體TNF-αR1mRNA在增生性瘢痕組織中的表達(dá)及意義[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2004，26（5）：266-268.

[12]袁瑞紅，劉流，趙德萍，等.TNF-α對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞影響的研究[J].廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（5）：607-609.

[13]楊文玖，鄒云雯，王志杰，等.腫瘤壞死因子-α對(duì)NIH3T3細(xì)胞成熟化作用的影響[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2010，25（3）：235-237.

[14]石光清，支科.β射線敷貼照射治療增生性瘢痕機(jī)制及與腫瘤壞死因子-α關(guān)系研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（10）：1546-1550.

[15] Zhang H G，Huang N，Liu D，et al.Gene therapy that inhibits nuclear translocation of nuclear fact or KB results in tumor necrosis factor α-induced apoptosis of human synovial fibroblasts[J].Arithritis Rheum，2000，43（5）：1094-1105.

[16]陳釗，李小靜，王暉.構(gòu)建腫瘤壞死因子α刺激基因6慢病毒表達(dá)及干擾載體及對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].中國(guó)組織工程研究，2016，20（29）：4319-4327.

[17]田小雨，李小靜，李心怡，等.TSG-6調(diào)控PI3K/Akt-Bcl-2通路影響人瘢痕疙瘩凋亡機(jī)制的研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，53（4）：563-567.

[18]付晉鳳，譚加.病理性瘢痕的發(fā)生機(jī)制與修復(fù)[J/OL].中華損傷與修復(fù)雜志（電子版），2013，8（4）：347-353.

[19]周俐，石光清，邱娟.β射線照射治療增生性瘢痕患者血清腫瘤壞死因子的變化及意義[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2013，20（5）：315-318.

[20]李天石，曾文妮，何君君.甲殼素及其衍生物抑制瘢痕形成：研究與進(jìn)展[J].中國(guó)組織工程研究，2014，18（52）：8504-8508.

（收稿日期：2018-10-29） （本文編輯：董悅）