賀新生 趙 苗 王亞洲 張 能 譚仁豪 王 銀 竹文坤 陳 波

羊肚菌菌絲間融合與不融合現(xiàn)象研究

賀新生 趙 苗 王亞洲 張 能 譚仁豪 王 銀 竹文坤 陳 波

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

用平板、空試管、斷培養(yǎng)基等方法培養(yǎng)羊肚菌菌絲，在顯微鏡下原位直接觀察菌絲間的融合和非融合現(xiàn)象。觀察六妹羊肚菌、梯棱羊肚菌、七妹羊肚菌、Mel-21和秋天羊肚菌、Mes-16、Mes-19、Mes-20、Mes-21等9個(gè)物種，共100多個(gè)菌株菌絲間2 000多個(gè)接觸點(diǎn)；并歷經(jīng)6年時(shí)間，用300多個(gè)菌株在國(guó)內(nèi)外100多個(gè)地點(diǎn)超過(guò)500公頃面積進(jìn)行出菇試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：同一單孢菌株的菌絲分枝間有少量部位的可自體融合，融合點(diǎn)不產(chǎn)生新的分枝菌絲；同一物種的不同單孢菌株間菌絲不融合，同一物種的多孢菌株培養(yǎng)物內(nèi)部相互不融合；不同物種間的菌絲都不融合；不融合的菌絲接觸點(diǎn)出現(xiàn)II型、X型、Y型、T型、π型等狀況交叉而過(guò)，細(xì)胞接觸而不融合；未見(jiàn)菌絲間的有性融合；菌絲接觸后出現(xiàn)死亡、纏繞、卷曲、打結(jié)、膨大等現(xiàn)象；羊肚菌菌絲體純培養(yǎng)物可以形成分生孢子和菌核。出菇試驗(yàn)結(jié)果表明，腐生型羊肚菌物種的出菇率，超過(guò)200個(gè)單孢菌株100%，超過(guò)100個(gè)多孢菌株100%，超過(guò)50個(gè)純組織分離物小于50%，超過(guò)30個(gè)組孢混合菌株小于50%；出菇菌株在形態(tài)和產(chǎn)量有顯著差異。共生型羊肚菌的菌種都不出菇。能出菇的同一物種的多孢菌株出菇后表現(xiàn)出子實(shí)體形態(tài)多樣性，不同物種混合播種后出菇的子實(shí)體為原來(lái)物種的形態(tài)特征。結(jié)論：羊肚菌單孢培養(yǎng)物菌絲間不發(fā)生有性融合，單個(gè)孢子自身可孕，完全能夠單孢出菇。

羊肚菌菌絲；單孢出菇；有性融合；顯微鏡原位直接觀察；菌絲空試管培養(yǎng)法

菌絲融合是所有絲狀真菌的物種在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中普遍發(fā)生的一種現(xiàn)象。菌絲融合的類(lèi)型分為：無(wú)性融合、有性融合。無(wú)性融合是同一細(xì)胞發(fā)育的菌絲相鄰分枝之間發(fā)生的自體融合；同一物種的不同菌株的菌絲之間會(huì)發(fā)生無(wú)性融合；菌絲在無(wú)限的無(wú)性繁殖過(guò)程中相鄰菌絲之間產(chǎn)生分枝或直接接觸，相互融合使得菌絲之間形成三維立體的網(wǎng)絡(luò)，有利于占據(jù)更大的生存空間和營(yíng)養(yǎng)源，有利于對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收與運(yùn)輸、信息傳遞和菌絲體、子實(shí)體的生長(zhǎng)。有性融合是在兩個(gè)不同性別的單孢菌株菌絲之間，菌絲接觸后相互融合，形成具有全部基因組的新細(xì)胞，新細(xì)胞萌發(fā)出新菌絲，完成有性生殖，成功繁殖下一代，形成大量有性孢子，如子囊孢子、擔(dān)孢子、接合孢子。無(wú)性融合、有性融合都可用于物種的鑒定，有性融合多用于雜交育種。

在異宗結(jié)合真菌的有性生殖過(guò)程中，2個(gè)不同性別的可親和的單孢單核菌絲相互接觸后，細(xì)胞發(fā)生有性融合，形成一個(gè)新的雙核異核細(xì)胞，由此細(xì)胞開(kāi)始萌發(fā)出新的可以完成有性生活史的雙核異核菌絲，原來(lái)的單核菌絲逐漸死亡或不再生長(zhǎng)。顯微鏡下可以直接觀察到融合以后的細(xì)胞上長(zhǎng)出新的菌絲的現(xiàn)象。異宗結(jié)合的擔(dān)子菌中單個(gè)單核菌絲不會(huì)出菇，2個(gè)或多個(gè)同性別的單孢培養(yǎng)物混合培養(yǎng)也不會(huì)出菇，只有2個(gè)或2個(gè)以上的不同性別的培養(yǎng)物混合培養(yǎng)后才會(huì)出菇。因此對(duì)一個(gè)物種是否是異宗結(jié)合，是否可以進(jìn)行雜交育種的判斷法則是：?jiǎn)捂吲囵B(yǎng)物不出菇，可親和的菌絲間細(xì)胞發(fā)生融合，融合以后的新菌絲具有鎖狀聯(lián)合，可形成新的子實(shí)體和有性孢子。

羊肚菌屬于子囊菌門(mén)，子囊菌的菌絲可能有不結(jié)實(shí)和可結(jié)實(shí)的菌絲，因?yàn)槿狈?dān)子菌門(mén)菌絲的鎖狀聯(lián)合和其他形態(tài)學(xué)特征，純培養(yǎng)物難形成子實(shí)體，無(wú)法根據(jù)菌絲形態(tài)來(lái)判斷子囊菌的培養(yǎng)物的可結(jié)實(shí)性和不同性別的菌絲之間是否交配成功。要證明單孢菌株菌絲之間有交配行為，必須要有顯微鏡下原位直接觀察的證據(jù)，確證菌絲之間有普遍的有性融合現(xiàn)象，否則無(wú)法判斷結(jié)論是否正確。用壓片法觀察菌絲，制片過(guò)程中容易打亂菌絲的自然排列狀況；用掃描電子顯微鏡觀察菌絲也不能打亂菌絲的原始排列狀況，在技術(shù)上很難做到。

羊肚菌的菌絲很粗，一般直徑有5～20mm，有3～5或更多級(jí)的分枝，分枝級(jí)數(shù)越多尖端菌絲越細(xì)；老菌絲有一定的顏色，隔膜和分枝非常容易識(shí)別，都會(huì)形成特殊的菌核和分生孢子。由于菌絲直徑差異明顯，羊肚菌菌絲很容易與其他的絲狀真菌區(qū)分開(kāi)，如各種霉菌、擔(dān)子菌等，在低倍光學(xué)顯微鏡下可直觀地識(shí)別。要觀察菌絲之間的融合和非融合現(xiàn)象，可采用空試管培養(yǎng)、培養(yǎng)皿平板培養(yǎng)孢子萌發(fā)或菌絲，可在顯微鏡下原位直接觀察、拍照試管壁或打開(kāi)的培養(yǎng)皿正面、反面，很容易得出正確的結(jié)論。也可以用載玻片直接培養(yǎng)法、蓋玻片插片法培養(yǎng)，取下載玻片、蓋玻片在顯微鏡下原位觀察。

羊肚菌的菌絲在培養(yǎng)基中的空間分布情況為：在培養(yǎng)基內(nèi)部的基內(nèi)菌絲，表面的匍匐菌絲，培養(yǎng)基上空的氣生菌絲；菌核有培養(yǎng)基表面的菌核，氣生菌絲的菌核；分生孢子分布在氣生菌絲體尖端。要觀察菌絲之間是否融合就要分別觀察基內(nèi)菌絲、匍匐菌絲、氣生菌絲之間是否有接觸和融合、非融合的現(xiàn)象發(fā)生。

羊肚菌的每一個(gè)子囊中有8個(gè)子囊孢子，顏色、大小、形態(tài)差異不顯著，單個(gè)孢子、各種菌絲培養(yǎng)物都是多核體，在形態(tài)上沒(méi)有顯著性的差異，無(wú)法判斷其遺傳性別。其子囊孢子極易萌發(fā)，在有水的條件下萌發(fā)率一般超過(guò)90%，存活時(shí)間很長(zhǎng)，一般不會(huì)很快死亡，新生的菌絲在形態(tài)上沒(méi)有差異。要判斷單個(gè)孢子的結(jié)實(shí)性，可以通過(guò)單孢分離進(jìn)行出菇試驗(yàn)來(lái)加以證明。

羊肚菌的菌種很容易獲得，分離的方法很多，如純組織分離、單孢分離、多孢分離、組孢混合分離、土壤或基物菌絲分離等。各種分離物的培養(yǎng)特征沒(méi)有多大的差異，大多數(shù)能夠形成菌核，培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)20天后在顯微鏡下可以觀察到分生孢子的形成。組織分離有膨大細(xì)胞分離，緊密組織分離，膨大細(xì)胞和緊密組織混合分離等方法，分離部位有菌蓋、蓋柄結(jié)合部位、菌柄組織等。組孢混合分離是取子實(shí)體表面的產(chǎn)孢組織，從成熟新鮮子實(shí)體上取組織，就有菌蓋的菌肉組織和子囊孢子，萌發(fā)出的培養(yǎng)物是組孢混合分離物；取成熟的干子實(shí)體表面組織，孢子已經(jīng)成熟，孢子萌發(fā)比菌肉組織快24～48小時(shí)，應(yīng)是多孢分離物；取幼嫩子實(shí)體表面的組織，沒(méi)有成熟的孢子，是組織分離物。要確定是否出菇、出菇量的高低、質(zhì)量的好壞等必須進(jìn)行出菇試驗(yàn)。

為確定羊肚菌單孢菌株之間菌絲是否能夠發(fā)生菌絲的有性融合、可否進(jìn)行雜交，我們特設(shè)計(jì)了幾種顯微鏡下原位直接觀察的方法，對(duì)大量的培養(yǎng)物作了多年的研究，并進(jìn)行出菇試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行證實(shí)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗(yàn)用菌株是從9個(gè)物種的新鮮子實(shí)體或風(fēng)干子實(shí)體上分離所得，包括單孢分離物、單孢+單孢組合培養(yǎng)物、多孢分離物、純組織分離物、組孢分離物等。試驗(yàn)的9個(gè)物種均進(jìn)行過(guò)分子系統(tǒng)學(xué)鑒定確認(rèn)。

（1）可出菇的物種。六妹羊肚菌：學(xué)名M. Kuo, in Kuo, Dewsbury, O'Donnell, Carter, Rehner, Moore, Moncalvo, Canfield, Stephenson, Methven & Volk,104(5): 1170 (2012)。M5原始標(biāo)本來(lái)自四川省廣元市青川縣青溪鎮(zhèn)，200個(gè)分離物。M909原始標(biāo)本來(lái)自四川省阿壩州九寨溝縣，80個(gè)分離物。M1018原始標(biāo)本為四川栽培菌株，100個(gè)分離物。G19原始標(biāo)本為四川栽培菌株，30個(gè)分離物。

梯棱羊肚菌：學(xué)名M. Kuo, O'Donnell & T.J. Volk, in Kuo, Dewsbury, O'Donnell, Carter, Rehner, Moore, Moncalvo, Canfield, Stephenson, Methven & Volk,104(5): 1172 (2012)。Mma原始標(biāo)本來(lái)自新疆的馬鞍菌子實(shí)體，組織分離物。Mjt原始標(biāo)本來(lái)自四川栽培菌株，40個(gè)分離物。Mb原始標(biāo)本來(lái)自巴基斯坦野生標(biāo)本，20個(gè)分離物。

七妹羊肚菌：學(xué)名M. Kuo, in Kuo, Dewsbury, O'Donnell, Carter, Rehner, Moore, Moncalvo, Canfield, Stephenson, Methven & Volk,104(5): 1171 (2012)。M7原始標(biāo)本來(lái)自北川縣栽培菌株。30個(gè)分離物。

Mel-21：四川省綿陽(yáng)市安州區(qū)桑棗鎮(zhèn)野生標(biāo)本，5個(gè)分離物。

（2）不出菇的菌種。秋天羊肚菌：學(xué)名Masaphy & Clowez, in Clowez,. 126(3-4): 238 (2012) [2010]。野生標(biāo)本來(lái)自西南科技大學(xué)校園，30個(gè)分離物。

野生羊肚菌：Mes-16、Mes-19、Mes-20、Mes-21，野生標(biāo)本來(lái)自金堂縣竹篙鎮(zhèn)、中江永安鎮(zhèn)、南部、平武鎖江鎮(zhèn)、平武平通鎮(zhèn)、平武壩子鄉(xiāng)、廣元朝天區(qū)等地，各10個(gè)以上的孢子分離物。

1.2 培養(yǎng)基

水瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、PDA加富培養(yǎng)基[1～7]。

1.3 菌種分離方法

[1~3]的方法，得到試驗(yàn)用菌株。

1.4 菌絲觀察方法

培養(yǎng)皿培養(yǎng)直接觀察法：孢子接種在有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；培養(yǎng)物帶培養(yǎng)基的菌絲塊接種在無(wú)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，接種塊間距1～2 cm，培養(yǎng)溫度22～25 ℃，菌絲萌發(fā)接觸后進(jìn)行觀察。把培養(yǎng)皿打開(kāi)皿蓋，培養(yǎng)基朝上，放在光學(xué)顯微鏡載物臺(tái)上，先用4倍物鏡對(duì)焦，再用10倍、20倍、40倍、100倍物鏡觀察和拍照。移動(dòng)培養(yǎng)皿或試管，進(jìn)行多點(diǎn)觀察。培養(yǎng)基朝下，直接觀察培養(yǎng)皿背面。

空試管培養(yǎng)直接觀察法：將試管塞上橡皮塞后滅菌，冷卻后在試管中部接入2塊帶培養(yǎng)基的菌絲培養(yǎng)物，間距1～2 cm，25 °C培養(yǎng)，菌絲接觸把試管放在顯微鏡載物臺(tái)上，顯微鏡4倍物鏡調(diào)焦觀察，再用10倍物鏡觀察。

斷培養(yǎng)基觀察法：將培養(yǎng)皿中央的培養(yǎng)基挖去1～2 cm的長(zhǎng)條或圓條，在兩側(cè)接上不同的菌株?；?qū)⒃嚬苤械男泵媾囵B(yǎng)基挖斷并移動(dòng)，間隔1～2 cm，分別在2塊培養(yǎng)基上接種不同菌株。培養(yǎng)2～4天后，兩側(cè)的菌絲在斷面上接觸，用顯微鏡直接觀察培養(yǎng)皿或試管壁。

觀察層面：基內(nèi)菌絲，培養(yǎng)基表面貼生的匍匐菌絲，培養(yǎng)基上空的氣生菌絲。

觀察點(diǎn)：菌絲相互接觸的點(diǎn)、線(xiàn)，菌絲分枝頂端，氣生菌絲尖端，超過(guò)2 000個(gè)觀察點(diǎn)。

觀察材料：?jiǎn)捂呔z>200個(gè)菌株，同種或異種的單+單組合培養(yǎng)物>50個(gè)菌種，同種或異種的多孢菌株>50個(gè)菌株，純組分菌株>50個(gè)菌株，組孢混合>30個(gè)菌株等。

1.5 菌絲融合與不融合的判斷

在培養(yǎng)皿中觀察菌絲相互接觸處，在接觸點(diǎn)調(diào)節(jié)顯微鏡焦距，多焦距立體觀察。

菌絲融合：菌絲接觸點(diǎn)細(xì)胞無(wú)隔膜，接觸處不膨大或異形。沿菌絲的生長(zhǎng)方向移動(dòng)載物臺(tái)，確認(rèn)融合的2個(gè)分枝是否發(fā)源于同一根菌絲。變化焦距，觀察融合點(diǎn)是否有新菌絲形成。

不融合：菌絲接觸后距離幾乎為0或1～2mm，有或無(wú)明顯的隔膜，有或無(wú)膨大或異形細(xì)胞，有或無(wú)細(xì)小的分枝。變化焦距，觀察融合點(diǎn)是否有新分枝菌絲形成。

1.6 出菇試驗(yàn)

將分離得到的各種培養(yǎng)物，擴(kuò)大培養(yǎng)制作原種和栽培種，在大田進(jìn)行出菇試驗(yàn)。方法參考文獻(xiàn)[1～7]。時(shí)間：2013—2018年。地點(diǎn)：四川省、重慶市、云南省、貴州省、河南省、河北省、北京市、甘肅省、新疆維吾爾自治區(qū)、福建省、湖北省、陜西省、安徽省、湖南省等，美國(guó)、法國(guó)、澳大利亞等100多個(gè)點(diǎn)。累計(jì)面積超過(guò)500公頃。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲融合

結(jié)果如圖1、表1所示。在水、水瓊脂培養(yǎng)基或有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中，孢子在24小時(shí)內(nèi)萌發(fā)，大多數(shù)孢子粉的萌發(fā)率超過(guò)90%，新鮮組織塊在24～48小時(shí)萌發(fā)，干組織塊在48小時(shí)以后萌發(fā)。菌絲萌發(fā)以后，很快產(chǎn)生多級(jí)分枝，一般有4～6級(jí)。孢子萌發(fā)的單孢菌株、純組織分離菌株的菌絲產(chǎn)生分枝，相鄰菌絲之間產(chǎn)生的分枝相互接觸、或一根菌絲的分枝與另外一根菌絲接觸后，有部分接觸點(diǎn)能夠融合，即自體融合或無(wú)性融合。自體融合率小于接觸點(diǎn)總數(shù)的25%。接觸點(diǎn)細(xì)胞壁會(huì)溶解，無(wú)隔膜出現(xiàn)。超過(guò)75%的接觸點(diǎn)菌絲相互不融合。同一個(gè)菌株的不同接種塊萌發(fā)的菌絲之間接觸后會(huì)發(fā)生融合，即無(wú)性生長(zhǎng)的融合。所有的融合點(diǎn)都沒(méi)有觀察到新分枝菌絲的發(fā)生。

圖1 孢子萌發(fā)、多級(jí)分枝和自體融合

所有的多孢、混合培養(yǎng)物的同一根菌絲的分枝在少數(shù)接觸點(diǎn)上有自體融合現(xiàn)象，沿菌絲生長(zhǎng)方向進(jìn)行源頭追溯觀察，發(fā)現(xiàn)都是同一根菌絲產(chǎn)生的不同分枝。沒(méi)有觀察到有性融合。

2.2 菌絲不融合

所有的單孢菌株、同或異種單孢間、同或異種多孢菌株、純組織分離菌株、組孢混合菌株等的培養(yǎng)物的匍匐菌絲接觸點(diǎn)不融合的情況復(fù)雜多樣，相互接觸后都會(huì)出現(xiàn)下列幾種情況。

II型：相鄰的2根或更多數(shù)量的菌絲平行排列，菌絲間隔距離為0～2mm或更遠(yuǎn)，菌絲同向或反向平行排列，長(zhǎng)達(dá)2～5個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)度，即使距離為0，各自都有自己獨(dú)立的細(xì)胞壁，各自尖端的菌絲又相互分開(kāi)生長(zhǎng)在不同的空間區(qū)域。3根以上的平行排列成為菌絲束。如圖2左所示。

圖2 菌絲不融合：II型、X型排列

X型：相鄰的2根相交的菌絲呈X型、十字型交叉而過(guò)。交叉重疊處單獨(dú)或各自長(zhǎng)出短小分枝，有一根菌絲細(xì)胞在接觸處明顯膨大，都有自己獨(dú)立的細(xì)胞壁，變化顯微鏡的焦距完全可以清楚觀察到（圖2右）。

Y型：2根相交的菌絲呈Y字形交叉而過(guò)。重疊處各自長(zhǎng)出短小分枝，都有自己獨(dú)立的細(xì)胞壁（圖3左）。半Y型：2根相交的菌絲呈半Y字形交叉而過(guò)。重疊處各自長(zhǎng)出短小分枝，都有自己獨(dú)立的細(xì)胞壁。

T型：一根菌絲垂直接觸于另外一根菌絲，頂端不產(chǎn)生新的尖端菌絲，接觸處有各自的細(xì)胞壁。接觸處細(xì)胞稍膨大。如圖3右所示。

圖3 菌絲不融合：Y型、T型交叉

π型：2根菌絲接觸后，一根菌絲產(chǎn)生2個(gè)或2個(gè)以上的分枝繞過(guò)所接觸的菌絲，菌絲細(xì)胞壁不融合（圖4左）。繞過(guò)：菌絲交叉處一根菌絲與另外一根菌絲平貼一小段，再繞過(guò)去，繼續(xù)生長(zhǎng)。

細(xì)胞膨大：羊肚菌菌絲在培養(yǎng)基中容易產(chǎn)生連續(xù)或不連續(xù)的膨大細(xì)胞，膨大后比原菌絲直徑增加0.5～2倍（圖4右）。S型菌絲：菌絲波浪狀、卷曲狀，不直。在有其他雜菌存在的培養(yǎng)物中容易觀察到。

圖4 菌絲π型排列和細(xì)胞膨大

2.3 菌絲死亡

在顯微鏡下，各種培養(yǎng)物都容易觀察到羊肚菌菌絲細(xì)胞死亡的情況。死亡菌絲發(fā)生的部位為菌絲尖端和菌絲中段，在氣生菌絲和匍匐菌絲上都容易觀察到。氣生菌絲尖端容易發(fā)生相互纏繞、自身卷曲、相互打結(jié)等現(xiàn)象，結(jié)節(jié)以后死亡的菌絲，不再發(fā)生新的菌絲。

尖端死亡：一根菌絲與另外一根菌絲接觸后，尖端菌絲成為空細(xì)胞，或表面堆積大量紫紅色顆粒物，細(xì)胞干癟或變成空腔，然后死亡（圖5左）。

中段死亡：一根菌絲與另外一根菌絲交叉而過(guò)以后，繼續(xù)生長(zhǎng)，接觸段的2～5個(gè)細(xì)胞形成空腔細(xì)胞，死亡（圖5右）。

氣生菌絲相互接觸后發(fā)生纏繞、卷曲和打結(jié)現(xiàn)象。纏繞：最細(xì)的分枝菌絲常常纏繞在較大的菌絲上，纏繞的圈數(shù)有1圈至多圈。氣生菌絲最細(xì)的分枝在尖端接觸后也會(huì)相互纏繞（圖6左）。卷曲：菌絲頂端呈圓形卷曲1圈或多圈，呈圓盤(pán)狀（圖6右）。打結(jié)：細(xì)小的分枝菌絲相互纏繞后成為一個(gè)小的菌絲團(tuán)（圖6右）。

圖5 菌絲尖端死亡和中段死亡

圖6 菌絲纏繞、卷曲、打結(jié)

2.4 無(wú)性繁殖體

各種羊肚菌菌絲純培養(yǎng)物中都容易觀察到其無(wú)性繁殖體：分生孢子梗和分生孢子、假菌核。

分生孢子梗和分生孢子：所有的培養(yǎng)物中，在培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)20天的老培養(yǎng)物上容易觀察到菌絲形成的分生孢子梗和分生孢子。培養(yǎng)時(shí)間短的培養(yǎng)物中很難觀察到（圖7左）。

圖7 羊肚菌純培養(yǎng)菌絲上的分生孢子（左）和菌核（右）

假菌核或菌核：在所有的培養(yǎng)物中，肉眼或顯微鏡下可以觀察到大小不等的菌絲扭結(jié)塊即假菌核，稍堅(jiān)硬或柔軟，系菌絲在一個(gè)節(jié)點(diǎn)大量發(fā)生短分枝相互纏繞、或密集排列、膨大或不膨大、集群而成（圖7右）。菌核常常發(fā)生在培養(yǎng)基表面的匍匐菌絲、氣生菌絲上，貼生于培養(yǎng)基表面或試管壁上。基內(nèi)菌絲上沒(méi)有觀察到菌核的發(fā)生。

2.5 出菇試驗(yàn)

2013—2018年在國(guó)內(nèi)外多地進(jìn)行出菇試驗(yàn)和推廣應(yīng)用。結(jié)果（表1）表明，單孢菌株、單+單菌株、種內(nèi)多孢菌株、種間多孢菌株都能夠出菇，出菇率為100%，可以多年重復(fù)出菇，小區(qū)試驗(yàn)產(chǎn)量在0.5～2.4 kg/m2范圍，大面積推廣應(yīng)用的產(chǎn)量達(dá)到100～498.5 kg/667m2。各物種的產(chǎn)量依次為：梯棱羊肚菌>六妹羊肚菌>七妹羊肚菌>Mel-21。單孢菌株的形態(tài)、質(zhì)量都比較一致，多孢分離物、混合播種的子實(shí)體形態(tài)變化大、同一栽培基地同樣栽培方法的產(chǎn)量差異顯著。

純組織分離的菌株、組織和孢子混合分離的菌株出菇率小于50%，有的菌株可以連續(xù)多年出菇，有的產(chǎn)量不穩(wěn)定，一年高一年低，小區(qū)試驗(yàn)產(chǎn)量在0.1～1.2 kg/m2范圍。能夠出菇的菌株在子實(shí)體形態(tài)和產(chǎn)量都有顯著差異。如菌蓋的圓整程度，有的很圓，有的呈明顯的扁圓形；頂部有尖頂、圓頂、方頂?shù)取Ｄ艹龉降耐晃锓N的多孢菌株出菇后子實(shí)體形態(tài)表現(xiàn)出多樣性，不同物種混合播種后出菇的子實(shí)體呈現(xiàn)原物種的形態(tài)特征。

秋天羊肚菌、Mes-16、Mes-19、Mes-20、Mes-21等共生型的羊肚菌，組織分離和孢子分離菌種都可以產(chǎn)生菌核和分生孢子，但是都不出菇。

表1 羊肚菌菌絲間的融合與不融合及出菇試驗(yàn)結(jié)果

注：*為不能出菇的物種不出菇。表內(nèi)“+”表示有，“﹣”表示無(wú)；“純單”為一個(gè)孢子的純培養(yǎng)物，“單+單”為2個(gè)不同的單孢培養(yǎng)物，“多孢”為多個(gè)孢子混合培養(yǎng)物，“純組”為純組織分離的培養(yǎng)物，“組+孢”為組織分離與孢子分離的混合培養(yǎng)物。

3 討 論

顯微鏡原位直接觀察羊肚菌菌絲，發(fā)現(xiàn)能夠出菇或不能夠出菇的菌種的每一個(gè)單孢菌株，部分菌絲的分枝、頂端之間接觸后容易發(fā)生融合。接觸后細(xì)胞壁溶解，結(jié)合處不形成隔膜?；鶅?nèi)菌絲不容易發(fā)生融合。很多匍匐菌絲、氣生菌絲相互接觸后也不發(fā)生融合，而是出現(xiàn)菌絲相互交叉排列現(xiàn)象。氣生菌絲會(huì)發(fā)生卷曲、纏繞、打結(jié)等現(xiàn)象。所有單孢培養(yǎng)物在通氣良好的培養(yǎng)皿、棉塞試管培養(yǎng)物中都容易形成菌核。純單孢培養(yǎng)物培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)20天以后，在顯微鏡下能夠觀察到氣生菌絲尖端形成的分生孢子梗和分生孢子，但肉眼無(wú)法看到。數(shù)百個(gè)單孢菌株的出菇試驗(yàn)和生產(chǎn)應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，能出菇的腐生型菌種的單孢菌株100%都可以出菇，子實(shí)體形態(tài)一致，沒(méi)有完全不出菇的現(xiàn)象發(fā)生，菌株間、物種間的產(chǎn)量有明顯差異。

沒(méi)有觀察到同一物種不同單孢菌株間菌絲發(fā)生有性融合的現(xiàn)象，表明同種之間單孢菌株雜交的可能性非常??；不同物種的單孢菌株之間菌絲發(fā)生融合的現(xiàn)象沒(méi)有觀察到，表明異種之間雜交的可能性也非常小。

同種、異種的多孢菌株的培養(yǎng)物菌絲間沒(méi)有觀察到不同菌絲之間的有性融合現(xiàn)象。在水瓊脂培養(yǎng)基上，菌絲接觸后尖端菌絲大多數(shù)變成空腔菌絲，表面堆積大量紫褐色物質(zhì)。栽培菌株出菇后表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)上的多樣性，有圓形、橢圓形、扁平形、片狀等，菌株間產(chǎn)量差異極顯著。

純組分菌株與單孢菌絲培養(yǎng)物的特征相似。能夠人工栽培的物種部分菌株會(huì)出現(xiàn)不出菇或難出菇的情況，第二年無(wú)法重復(fù)第一年的結(jié)果。組孢混合菌株與多孢培養(yǎng)物的狀況相似。菌絲雖有融合的現(xiàn)象，但95%以上的接觸點(diǎn)都是不融合。

大量試驗(yàn)研究結(jié)果表明，羊肚菌出菇與不出菇菌種的各類(lèi)分離物菌絲間的融合與不融合規(guī)律基本相同。在不同的單孢培養(yǎng)物菌絲間沒(méi)有觀察到有性融合，羊肚菌孢子自身可孕，完全能夠單孢出菇，遺傳類(lèi)型不屬于典型的異宗結(jié)合真菌。羊肚菌單孢雜交、多孢雜交、異種雜交的可能性極低或不會(huì)發(fā)生，這與大多數(shù)研究者的結(jié)論截然不同。

考慮到多孢菌株中菌絲之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，相互纏繞，尖端菌絲容易死亡等情況，栽培過(guò)程中容易出現(xiàn)產(chǎn)量、形狀和質(zhì)量等不穩(wěn)定的問(wèn)題，建議生產(chǎn)者多采用經(jīng)過(guò)出菇試驗(yàn)的高產(chǎn)單孢菌株進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，以避免不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

目前普遍采用從孢子粉的稀釋液中分離單孢的方法進(jìn)行單孢分離，因而獲得的單孢來(lái)自于同一個(gè)子囊的概率幾乎為0。所以羊肚菌孢子分離的難點(diǎn)，是把同一個(gè)子囊中的8個(gè)孢子分離出來(lái)，單個(gè)分開(kāi)培養(yǎng)，以便于對(duì)它們進(jìn)行遺傳差異的比較研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 賀新生. 羊肚菌生物學(xué)基礎(chǔ)、菌種分離制作與高產(chǎn)栽培技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2017.

[2] 賀新生. 野生蕈菌生物學(xué)特性與栽培技術(shù)[M]. 北京: 中國(guó)輕工出版社, 2007.

[3] 賀新生. 羊肚菌研究進(jìn)展[J]. 食用菌文摘, 1993(1): 1-9.

[4] 賀新生, 張玲, 李玉律, 等. 羊肚菌菌絲體的培養(yǎng)[J]. 資源開(kāi)發(fā)與市場(chǎng), 1994(1): 23-25.

[5] 賀新生, 陳波, 劉超洋. 中國(guó)羊肚菌栽培技術(shù)新進(jìn)展[C]. 中國(guó)菌物學(xué)會(huì)第六屆會(huì)員代表大會(huì)(2014年學(xué)術(shù)年會(huì))暨貴州省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展高峰論壇, 2014.

[6] 賀新生. 羊肚菌人工栽培技術(shù)穩(wěn)定性和規(guī)范化程度有待提高[C]. 2018第三屆全國(guó)羊肚菌大會(huì)資料匯編, 2018.

[7] 賀新生, 張能, 趙苗, 等. 栽培羊肚菌的形態(tài)發(fā)育分析[J]. 食藥用菌, 2016(4): 222-229.

Study on the Hyphal Fusion and Non-Fusion Phenomena between Morels

He Xinsheng Zhao Miao Wang Yazhou Zhang Neng Tan Renhao Wang Yin Zhu Wenkun Chen Bo

(School of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang, Sichuan, 621010, China)

The hyphae of morels was cultured in flat plate, empty test tube and broken inclined medium. The fusion and non-fusion phenomenon between mycelia were observed in situ under the microscope. Including 9 species:,,, Mel-21 and, Mes-16, Mes-19, Mes-20 and Mes-21. There are more than 2 000 contact points between mycelia of more than 100 strains. After six years, mushroom production experiments were carried out with over 300 strains in more than 100 locations and over 500 hectares around the world. The results showed that the self-fusion of a few parts between the mycelial branches of the same monospora strain, and the fusion point did not produce new mycelia; the mycelia of the same species did not fuse, and the polyspore strain cultures of the same species did not fuse with each other; the mycelia of different species did not fuse; the incompatible mycelial contact points appeared: type II, type X, type Y, type T, typeπ, etc. , the cells contacted but did not fuse; the sexual fusion between mycelia was not observed. The phenomena of death, winding, curling, knotting and swelling were observed after hyphal contact. The pure culture of morels mycelium could form asexual propagates such as conidiospores and sclerotium. The results of mushroom production test showed that the mushroom production rates of saprophyticspecies were 100% of more than 200 single-spore strains, 100% of more than 100 polyspores strains, less than 50% of more than 50 pure tissue isolates and less than 50% of more than 30 mixed strains. There were significant differences in morphology and yield of the mushroom producing strains, and none of the symbioticstrains produced mushrooms. The fruiting bodies of the same strain of mushroom-producing species showed morphological diversity after mushroom-producing. The fruiting bodies of different species after mixed sowing were the morphological characteristics of the original species. CONCLUSION: Sexual fusion does not occur between any mycelia of single-spore cultures of. Morels spores are self-fertility and can produce fruiting bodies by single-spore, and the genetic type is not the typical heterothallic fungi.

hyphae; single-spore produce fruiting bodies; sexual fusion of hyphae; microscopic in situ direct observation; method of mycelium culture in empty test tube

S646

A

2095-0934（2019）04-244-09

四川省科技廳項(xiàng)目（2019YFN0125）

賀新生（1965.04—），男，教授，碩士導(dǎo)師，主要從事食藥用菌生物學(xué)和開(kāi)發(fā)利用方面的研究。E-mail：hexinsheng@swust.edu.cn。