王夢如， 張秀清， 王穎， 周思彤， 楊自忠， 李龍星， 楊志斌*

(1. 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000； 2. 藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南大理671000； 3. 中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南大理671000；4.大理大學(xué)分析測試中心，云南大理671000)

顏氏大疣蛛Macrotheleyani隸屬于蛛形綱Arachinida蜘蛛目Araneae后紡亞目Opisthothelae原蛛下目Mygalomorphae大疣蛛科Macrothelidae，最早由Xu等(2002)發(fā)現(xiàn)于云南省高黎貢山并以單性雌蛛報道，Shi等(2018)發(fā)現(xiàn)了雄蛛并對雌蛛的部分特征進(jìn)行了補(bǔ)充描述。本種與單卷大疣蛛M.monocirculata相似，但單卷大疣蛛的兩性均具觸肢轉(zhuǎn)節(jié)槳狀毛發(fā)聲器而顏氏大疣蛛雌雄均無。該種廣泛分布于云南的西北部地區(qū)，不同地區(qū)雄性個體觸肢器的長度和形狀一致，而雌性個體納精囊的長度和形狀多變(張蕊，2007)。目前除了對顏氏大疣蛛的形態(tài)鑒別以外，暫未有其他相關(guān)報道。

蛛毒現(xiàn)已逐漸成為生物毒素研究的新熱點(diǎn)，其含有大量具有潛在藥用價值的新型化合物，在生物和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中占有重要地位。但野生蜘蛛馴養(yǎng)難，與其他毒素相比，蛛毒量少且不易采集，很難進(jìn)行深入的研究(黃新等，2007；Klintetal.，2012；Windleyetal.，2012)。目前本課題組已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對顏氏大疣蛛的人工養(yǎng)殖并在取毒技術(shù)上取得了進(jìn)展，成功實(shí)現(xiàn)了對蛛毒的富集(圖1)。本試驗(yàn)利用超高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-ESI-Q-TOF-MS)技術(shù)和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)分離和鑒定了顏氏大疣蛛粗毒中多肽和蛋白質(zhì)的組成，首次對其富含的多肽與蛋白質(zhì)的多樣性進(jìn)行了探索，為后續(xù)對該毒素的物質(zhì)基礎(chǔ)研究及藥用開發(fā)提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器材料

質(zhì)譜儀(compact QTOF，Bruker)，超高效液相色譜儀(UltiMate 3000，戴安)，電子天平(BSA124S，賽多利斯)，垂直電泳儀(Mini-Protein，Bio-Rad)，低溫高速離心機(jī)(5430R，Eppendorf)，冷凍干燥機(jī)(FD8-4a，GOLD-SIM)。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(20171120，Solarbio)，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(101218181015， 碧云天5×)，甘氨酸(418Q066，Solarbio)，Tris(527K073，Solarbio)，SDS(323A033，Sigma)，Marker(20160425，Solarbio 11～180 kDa)，考馬斯亮藍(lán)G-250(No.C8430，Solarbio)，乙腈(178497，TEDIA)，三氟乙酸(TFA； 17040277，TEDIA)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為超純水。

圖1 顏氏大疣蛛的養(yǎng)殖(A)與取毒(B)技術(shù)Fig. 1 The breeding (A) and venom collection (B)techniques of Macrothele yani

1.2 蛛毒

蛛毒取自顏氏大疣蛛成蟲，蟲種由大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院楊自忠教授采自模式產(chǎn)地，現(xiàn)存于大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院。供試個體的養(yǎng)殖與取毒均由大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院養(yǎng)殖基地完成。用透明、通風(fēng)良好的塑料盒進(jìn)行飼養(yǎng)，內(nèi)部搭建人工庇護(hù)所。飼養(yǎng)條件：溫度26 ℃±1 ℃，相對濕度60%±5%，避光。

1.3 粗毒收集

將一次性離心管作為毒液接收器，從側(cè)面夾住蜘蛛胸部將其固定，用手固定蜘蛛的步足，讓蜘蛛張開鰲牙并咬住離心管內(nèi)壁，用自制脈沖電流取毒器(電壓6 V)的正、負(fù)兩極分別接觸蜘蛛的左右鰲肢，間斷刺激3～5 s。用少量超純水沖洗螯牙和內(nèi)壁上的毒液至離心管內(nèi)，每兩周采集一次。收集足量的毒液后經(jīng)真空冷凍干燥得白色或略帶黃色的粉末，即為粗毒粉末，-20 ℃保存。

1.4 供試品溶液的制備

取一定量的粗毒粉末用超純水溶解至濃度為30 mg·mL-1，4 ℃ 10 000 r·min-1離心10 min，0.22 μm濾膜濾過得到供試品溶液。

1.5 SDS-PAGE檢測

采用SDS-PAGE測定供試品溶液的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量，使用5%濃縮膠和12%分離膠，具體操作參考SDS-PAGE凝膠制備試劑盒說明書。電泳完成后用考馬斯亮藍(lán)G-250染色。蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的計算方法如下：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量(Mw)的對數(shù)(lgMw)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率(Rf)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程及回歸系數(shù)。將樣品的Rf值代入回歸方程計算出lgMw，從而得到樣品的相對分子質(zhì)量。Rf=L1/L2，其中，L1為加樣孔至條帶中心的距離，L2為加樣孔至溴酚藍(lán)區(qū)帶的距離。

1.6 UPLC-ESI-Q-TOF-MS檢測

色譜條件：使用超高效液相色譜儀，色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×150 mm，2.7 μm)，流動相為0.1%TFA水溶液(A)-0.1%TFA乙腈(B)，梯度洗脫(0～13.92 min，5%→21%B；13.92～21.57 min，21%B；21.57～83.25 min，21%→95%B)，流速0.2 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長為214 nm，柱溫30 ℃。

質(zhì)譜條件：使用高分辨質(zhì)譜儀，離子源采用電噴霧離子源，正負(fù)離子檢測模式，毛細(xì)管電壓3 500 V，掃描范圍300～3 000 m/z，霧化器氣體壓力2.0 Bar，干燥氣體流速8.0 L·min-1，干燥加熱溫度200 ℃。

1.7 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析采用Bruker的Data Analysis 4.0，數(shù)據(jù)的整合及作圖采用GraphPad Prism 5.01和Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗毒的SDS-PAGE分析

利用SDS-PAGE對顏氏大疣蛛粗毒中蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量分布進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，樣品的SDS-PAGE最佳上樣量為15 μL。電泳圖譜中，除相對分子質(zhì)量在11 kDa以下的多肽外，其他蛋白質(zhì)主要分布在35 kDa以上的區(qū)域。其中，在17～135 kDa的區(qū)域內(nèi)，分離度較佳的條帶共有11條，75 kDa附近區(qū)域彌散著高豐度的蛋白質(zhì)條帶，75 kDa 以上的區(qū)域蛋白質(zhì)最為豐富，分布過密，未能實(shí)現(xiàn)良好分離(圖2)。

圖2 顏氏大疣蛛粗毒的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig. 2 The sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis results of the crude venom of Macrothele yani

a. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)， b～e. 上樣量分別為5 μL、10 μL、15 μL和20 μL

a. Marker， b-e. the amount of loading is 5 μL， 10 μL， 15 μL and20 μL， respectively

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)條帶繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，回歸方程lgMw=-1.332 8Rf+2.392 5，r為0.992 3。將樣品中11條電泳條帶的Rf值代入公式計算，Mw依次為20 kDa、24 kDa、40 kDa、45 kDa、52 kDa、63 kDa、74 kDa、82 kDa、90 kDa、110 kDa和 122 kDa。由此可見，顏氏大疣蛛粗毒中中等分子量蛋白質(zhì)相對集中于40～120 kDa區(qū)域。

2.2 粗毒的UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析

顏氏大疣蛛粗毒的反相超高效液相色譜圖和質(zhì)譜總離子流圖見圖4。結(jié)果顯示，粗毒的成分復(fù)雜，在214 nm波長下可以檢測到超過50個色譜峰，其中保留時間為16.5 min的色譜峰吸收最強(qiáng)，其他大部分色譜峰于30～60 min內(nèi)被洗脫，屬于中等極性類的物質(zhì)成分，少部分色譜峰于10 min內(nèi)即被洗脫，屬于極性類的物質(zhì)成分(圖4：A)。經(jīng)ESI-Q-TOF-MS鑒定(圖4：B、C)，15 min內(nèi)的質(zhì)譜峰較少，該時間段的洗脫峰主要是小分子化合物和鹽類，大部分質(zhì)譜峰(30～60 min)為多肽類物質(zhì)，屬于粗毒中含量比較豐富的一類物質(zhì)。經(jīng)對質(zhì)譜正負(fù)離子模式下的離子峰進(jìn)行信號歸屬，去除冗余，大多數(shù)質(zhì)譜峰中均出現(xiàn)了2個以上的信號且多為多電荷離子。這說明很多疏水性相近、相對分子質(zhì)量有差異的多肽分子存在于同一洗脫峰中。本試驗(yàn)共分離和鑒定得到8個單一成分(表1)。

圖3 SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 The standard curve of molecular mass ofSDS-PAGE protein marker

2.3 粗毒的分子多樣性分析

從粗毒中分離和鑒定了121個物質(zhì)成分，展示了粗毒的分子多樣性(圖5：A)。粗毒中多肽的相對分子質(zhì)量呈典型的雙峰式分布，21%的多肽分子分布在500～2 000 Da附近區(qū)域，76%的多肽分子分布在3 000～5 000 Da區(qū)域內(nèi)(圖5：B)，此區(qū)域的多肽分子是粗毒中含量最為豐富的部分，后續(xù)可作為顏氏大疣蛛粗毒結(jié)構(gòu)與功能研究的主要部分。通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的梳理，以流分、質(zhì)荷比(m/z)和質(zhì)譜峰強(qiáng)度分別為X軸、Y軸和Z軸繪制顏氏大疣蛛粗毒中分子的三維分布圖(圖5：C)，展示了粗毒中所含成分的保留時間、相對分子質(zhì)量以及質(zhì)譜峰強(qiáng)度，特別是針對那些因疏水性相近而分離度不佳且有差異的多肽。主要的多肽分子群于35～60 min的保留時間內(nèi)被洗脫，Mw為3 000～5 000 Da，其中，45～60 min的時間段內(nèi)最多。

圖4 顏氏大疣蛛粗毒的超高效液相色譜圖和質(zhì)譜總離子流圖(+/-)Fig. 4 The UPLC chromatogram andtotal ion chromatograms (+/-) of mass spectrometry in the crude venom of Macrothele yani

a.色譜模式， B. 正離子模式， C. 負(fù)離子模式

a.the chromatographic mode， B. the positive ion mode， C. the negative ion mode

表1 顏氏大疣蛛粗毒中單一成分的相對分子質(zhì)量Table 1 Molecular mass of single component of the crude venom of Macrothele yani

3 討論

3.1 與其他蛛毒的多樣性比較

本文采用SDS-PAGE和LC-MS技術(shù)首次對顏氏大疣蛛粗毒的蛋白質(zhì)和多肽成分進(jìn)行了分子多樣性的初步探索，共分離和鑒定了121個物質(zhì)成分，其中，21%和76%的多肽物質(zhì)Mw分別分布在500～2 000 Da和3 000～5 000 Da的區(qū)域，呈雙峰式分布。粗毒中所含蛋白質(zhì)的Mw主要集中在40～120 kDa。該結(jié)果與已報道的漏斗網(wǎng)蛛Hadronycheversuta粗毒、敬釗纓毛蛛Chilobrachysjingzhao粗毒和虎紋捕鳥蛛Selenocosmiahuwena粗毒的多肽分子量分布研究結(jié)果類似。漏斗網(wǎng)蛛粗毒中多肽的Mw呈雙峰分布于3 000～5 000 Da和6 500～8 500 Da 2個區(qū)域(Escoubasetal.，2006)；敬釗纓毛蛛粗毒中70%的多肽Mw在3 000～5 000 Da，10%則分布于5 000～8 000 Da(Liaoetal.，2010)；虎紋捕鳥蛛粗毒中77.4%的多肽Mw在3 000～5 000 Da(Yuanetal.，2007)。這表明無論是顏氏大疣蛛蛛毒還是其他不同科的蛛毒，在物種進(jìn)化過程中存在一定的同源性，但具體差異或又體現(xiàn)了它們之間不同進(jìn)化方式的選擇。因此，進(jìn)一步研究顏氏大疣蛛與其他蛛毒的蛋白和多肽分子差異性，將有助于了解蛛毒的進(jìn)化機(jī)制及其生物活性機(jī)制。

3.2 多樣性分析方法的局限性

大多數(shù)動物類毒素均含有較為豐富的多肽和蛋白質(zhì)類活性物質(zhì)，利用電泳和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)相結(jié)合，對蛋白和多肽類物質(zhì)成分進(jìn)行分離和鑒定是目前常用的技術(shù)手段，具有專屬性好、靈敏度高和分析速度快等優(yōu)勢，目前已有利用相關(guān)技術(shù)對蛛毒等各類動物毒素研究的報道(Escoubas & Rash，2004；Escoubasetal.，2008；Duanetal.，2013)，但該技術(shù)也存在一定的局限性。想要對蛛毒中的多肽及蛋白類物質(zhì)的多樣性及其豐度有較為全面的了解，相對較困難，主要原因如下：(1)蛛毒的成分較為復(fù)雜，除了蛋白和多肽類物質(zhì)外，還有豐富的無機(jī)鹽和多胺類、氨基酸類及核苷酸類等小分子物質(zhì)(Ikonomopoulou & King，2013)，這些成分在質(zhì)譜中大多數(shù)易離子化，從而干擾多肽分子的離子化過程，造成檢測靈敏度低甚至無法檢出；(2)蛛毒中存在大量疏水性相似但分子量不同的多肽分子，利用反相液相色譜很難將其分離，從而導(dǎo)致在質(zhì)譜鑒定時難以區(qū)分。與MALDI-TOF質(zhì)譜易形成單電荷離子峰的特性相比，Q-TOF質(zhì)譜在分析生物大分子時通常會產(chǎn)生多電荷離子峰，更增加了解析的難度；(3)蛛毒中的多肽非常豐富，除豐度較大的多肽分子外，還有很多含量很低、現(xiàn)有質(zhì)譜技術(shù)很難鑒定和區(qū)分的物質(zhì)(Escoubasetal.， 2006)。綜上所述，這些影響因素可能也導(dǎo)致了本試驗(yàn)中經(jīng)分離和鑒定得到的多肽分子數(shù)目偏少，對顏氏大疣蛛粗毒的蛋白質(zhì)和多肽分子多樣性的分析存在一定的局限性。在后續(xù)研究中，可通過建立顏氏大疣蛛毒腺的cDNA文庫對其毒素的分子多樣性進(jìn)行進(jìn)一步的探討和補(bǔ)充。

圖5 顏氏大疣蛛粗毒的分子多樣性
Fig. 5 Molecular diversity of the crude venom inMacrotheleyani

a.結(jié)合超高效液相色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的顏氏大疣蛛粗毒分子質(zhì)量分布； B. 直方圖顯示了粗毒中分子質(zhì)量的分布頻率， 曲線顯示了粗毒中液質(zhì)鑒定成分的累計總數(shù)； C. 顏氏大疣蛛粗毒中分子的三維分布圖

a. Molecular mass distribution of the crude venom inMacrotheleyaniby RP-UPLC and ESI-Q-TOF-MS analysis； B. The histogram shows the frequency of molecular mass in the crude venom， the overlaid curve shows the cumulative total of component masses identified from UPLC-ESI-Q-TOF-MS analyses； C. 3D distribution of the crude venom inMacrotheleyani