韋盛 楊勇 趙東明 劉朝旭 吳華

骨折后骨骼修復(fù)愈合是一個很復(fù)雜的過程，包括早期的炎癥反應(yīng)期、修復(fù)期和骨痂形成期。早期的炎癥反應(yīng)從血管損傷出血形成血腫開始，局部聚集大量炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。血腫中富含可向多系分化的間充質(zhì)前體細(xì)胞。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子和生長因子，促進細(xì)胞匯聚到損傷部位而促進細(xì)胞的分化、膠原合成和血管生成，其中包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF-α），白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）及其他炎癥因子。由巨噬細(xì)胞生成的IL-1β可促進IL-6、前列腺素和其他繼發(fā)性的促炎癥信號因子的釋放，同時促進新鮮的血管生成和軟骨形成。IL-1β可以通過多種信號通路途徑參與多種細(xì)胞的損傷、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等活動，是炎癥反應(yīng)中極為重要的一個因素［1］。

同時電磁場刺激既可以促進骨折愈合，也能加速軟組織損傷的恢復(fù)，具體的作用效果跟電磁場的波形、場強、頻率、刺激持續(xù)時間及其他外界干預(yù)條件，如：培養(yǎng)基類型等，都有密切關(guān)系［2］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）具有多系分化的能力，在特定的電磁場刺激和外界干預(yù)作用下BMSCs可以向成骨、成軟骨或成脂肪分化［3］。

電磁場刺激能阻礙IL-1β對間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨生成的抑制作用［4］，但對于間充質(zhì)干細(xì)胞在電磁場和IL-1β影響下的成骨分化作用仍需進一步研究。IL-1β能單獨激活對成骨分化有重要作用的p38、ERK1/2和JNK1/2信號通路，它也可以和TNF-α一起激活p38和ERK1/2而降低BMP-2誘發(fā)的Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2,Runx2）表達(dá)［5］。

本研究旨在探討IL-1β和電磁場對大鼠BMSCs的成骨分化的作用，為電磁場在促進骨折恢復(fù)的臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Gibco，美國）；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，美國）；IL-1β（Peprotech，美國）；RIPA裂解液（博士德，中國）；Runx2、骨橋蛋白（osteopontin,OPN）、GAPDH和p38磷酸化抗體（Abcam，英國）；電磁場儀器由中國海軍工程大學(xué)制造提供。本實驗使用的電磁場類型為正弦交變電磁場，磁場參數(shù)：磁感應(yīng)強度1 mT，頻率50 Hz，每天刺激時間為4 h；5%二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Forma，美國）；臺式水平離心機（Heal Force，中國）；實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）儀，Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國）；酶標(biāo)儀（Bio Tek，美國）。

二、大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取及培養(yǎng)

取100 g左右的雄性大鼠（由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供）斷頸法處死后獲得其股骨和脛骨，用注射器吸取培養(yǎng)基沖洗出骨髓后吹打成細(xì)胞懸液種植到25 cm2無菌培養(yǎng)瓶，細(xì)胞長至90%左右鋪滿瓶底時用0.25%胰酶消化細(xì)胞并按1∶2比例傳代。第三代細(xì)胞按約1×105個/ml的密度種植到6孔板，隨機分為4組：對照組、IL-1β組、電磁場組和IL-1β+電磁場組。IL-1β組及IL-1β+電磁場組每次換新鮮培養(yǎng)基時每孔加入1 ng/ml的IL-1β，電磁場組和IL-1β+電磁場組每天用電磁場刺激4 h。隔天更換新鮮成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。另外取3塊未分組的6孔板培養(yǎng)細(xì)胞隔天換液待細(xì)胞長至90%左右鋪滿瓶底時提取蛋白質(zhì)。

三、熒光定量PCR檢測基因的表達(dá)

用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，每孔加入1 ml Trizol提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用SYBR Green熒光染料技術(shù)行熒光定量PCR，檢測堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、OPN、Runx2的基因表達(dá)。相關(guān)指標(biāo)的引物設(shè)計見表1。反應(yīng)條件：95℃變性5 s，55℃退火15 s，72℃延伸10 s，一共40個循環(huán)。用同樣方法分析經(jīng)過7 d培養(yǎng)刺激后ALP、OPN、Runx2的mRNA基因表達(dá)。用2-△△CT法進行相對定量計算。

四、Western blotting分析

用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，收獲利用RIPA提取的總蛋白，于垂直電泳槽中進行SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜后加OPN一抗、二抗孵育，底物化學(xué)發(fā)光ECL顯色后，Gel DocTMXR+成像系統(tǒng)曝光后進行分析同樣方法檢測Runx2蛋白的表達(dá)情況。另取兩組細(xì)胞，分別加入1 ng/ml的IL-1β，1 ng/ml的IL-1β+抑制劑SB203580后，給予15 Hz/1 mT的低頻正弦波電磁場刺激并分別于0、5、15、30、60及120 min提取蛋白質(zhì)，同樣方法檢測p38的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

五、統(tǒng)計方法

每組實驗均重復(fù)3次，用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件（IBM公司，美國）分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 RT-PCR引物序列

結(jié) 果

一、第3天實時定量PCR檢測

實時定量PCR檢測各組ALP、OPN、Runx2的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參，繪制各相關(guān)基因相對表達(dá)量。各實驗組中ALP、OPN基因的表達(dá)量均比對照組高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Runx2的基因表達(dá)水平在電磁場組及IL-1β+電磁場組比對照組高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

二、第7天實時定量PCR檢測

實時定量PCR檢測各組ALP、OPN、Runx2的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參，繪制各相關(guān)基因相對表達(dá)量。ALP基因在IL-1β組及IL-1β+電磁場組的表達(dá)量均比對照組低，在電磁場組的表達(dá)水平比對照組高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）（見圖2）。OPN基因在各組的表達(dá)量均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。Runx2基因在IL-1β組及IL-1β+電磁場組的表達(dá)水平均比對照組低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

三、Western blotting檢測

圖1 第3天ALP（a）、OPN（b）、Runx2（c）的mRNA表達(dá)水平 與對照組比較，*P＜0.05

圖2 第7天ALP（a）、OPN（b）、Runx2（c）的mRNA表達(dá)水平 與對照組比較，*P＜0.05

Western blotting檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過3 d培養(yǎng)后，各實驗組中OPN的蛋白表達(dá)均比對照組高（見圖3 a）。其中IL-1β+電磁場組的OPN蛋白表達(dá)水平最高，提示IL-1β可以協(xié)同電磁場促進OPN的表達(dá)。各實驗組中Runx2的蛋白表達(dá)均比對照組高（見圖3 b），IL-1β和電磁場均促進Runx2蛋白表達(dá)。檢測磷酸化的p38蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在IL-1β和電磁場作用30、60、120 min后磷酸化的p38的表達(dá)均比0 min時高（見圖4），而在加入p38抑制劑SB203580后，磷酸化的p38表達(dá)無明顯變化。

討 論

BMSCs是再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究領(lǐng)域常用的細(xì)胞類型，關(guān)于電磁場或IL-1β對BMSCs影響的研究較為深入。研究證實電磁場可以有效地促進BMSCs的成骨分化和細(xì)胞基質(zhì)的礦化，具體效果與電磁場頻率、強度、刺激時間、培養(yǎng)條件等因素密切相關(guān)［6］。脈沖電磁場在骨生成的早期明顯促進ALP的表達(dá)，在中期則促進礦化，在后期則提高細(xì)胞數(shù)量，另外還可以影響Runx2的表達(dá)［7］。研究表明IL-1β抑制小鼠BMSCs的增殖分化，但可以促進小鼠前成骨細(xì)胞的增殖分化［8］。IL-1β抑制BMSCs的Runx2和膠原的表達(dá)，但可以提高ALP活性［9］。BMSCs可以通過激活I(lǐng)L-1β的受體來減緩炎癥反應(yīng)的進程［10］，在骨折愈合過程中具有局部及全身的抗炎作用［11］。然而，IL-1β和電磁場對BMSCs的聯(lián)合作用尚未見報道。

本研究中將BMSCs經(jīng)過IL-1β和電磁場作用后，使用實時定量PCR方法檢測與成骨分化密切相關(guān)的指標(biāo)表達(dá)，如ALP、OPN及Runx2，結(jié)果顯示IL-1β干預(yù)3 d后，電磁場組和IL-1β+電磁場組的ALP和OPN的基因表達(dá)水平較對照組均有明顯的提高，并且電磁場的促進作用比IL-1β更強，而IL-1β+電磁場組兩者聯(lián)合應(yīng)用后可以發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。Runx2基因表達(dá)水平在IL-1β組變化不明顯，在電磁場組明顯升高，在IL-1β+電磁場組輕微增高。Western blotting檢測到OPN和Runx2蛋白的表達(dá)與其對應(yīng)基因表達(dá)趨勢相似。以上結(jié)果說明IL-1β和電磁場在促成骨相關(guān)基因的表達(dá)方面存在一定差異。經(jīng)過7 d的刺激后，ALP的基因表達(dá)水平在IL-1β組和IL-1β+電磁場組均降低，而在電磁場組則仍是表達(dá)升高。OPN的基因表達(dá)水平在各組均升高，以電磁場組尤為明顯。以上結(jié)果證明了電磁場可以促進大鼠BMSCs的成骨分化，且效應(yīng)比濃度為1 ng/ml的IL-1β更明顯。IL-1β在第3天促進ALP和OPN的基因表達(dá)，在第7天則抑制ALP基因表達(dá)，促進OPN的基因表達(dá)，檢測結(jié)果的差異提示IL-1β的作用可能與BMSCs所處的生長階段有關(guān)，可能在不同的細(xì)胞周期階段，其激活的信號通路和基因不盡相同，因而所起的促成骨分化作用也會有差異。IL-1β+電磁場組在第3天的ALP和OPN基因表達(dá)均升高，IL-1β和電磁場刺激聯(lián)合作用時的促進作用比單純應(yīng)用IL-1β刺激或電磁場刺激的作用均更強，而在第7天ALP基因表達(dá)較對照組和電磁場組都降低，OPN在IL-1β+電磁場組的表達(dá)低于單純電磁場組，這一現(xiàn)象提示在BMSCs生長的前3 d，聯(lián)合應(yīng)用IL-1β和電磁場能夠更好地促進其成骨分化。我們認(rèn)為，早期引入電磁場的干預(yù)可以更好地促進成骨。

圖3 電磁場和IL-1β作用3 d后的OPN（a）和Runx2（b）蛋白的表達(dá)

圖4 電磁場和IL-1β作用2 h內(nèi)的磷酸化p38蛋白的表達(dá)

p38的Western blotting結(jié)果提示在IL-1β和電磁場作用于大鼠BMSCs 30 min后，磷酸化的p38開始升高，提示p38的磷酸化通路被激活。而使用p38通路抑制劑SB203580后，磷酸化的p38表達(dá)無明顯差異。以上結(jié)果說明IL-1β和電磁場通過激活了p38信號通路，參與了BMSCs成骨分化過程。

綜上所述，我們認(rèn)為IL-1β在電磁場刺激的協(xié)調(diào)作用下，可在早期促進ALP和OPN的表達(dá)及p38信號通路的激活。然而，本研究尚有諸多不足，我們主要研究了IL-1β和電磁場對BMSCs早期成骨效應(yīng)的影響，需要進一步延長培養(yǎng)時間以檢測后期成骨作用。另外我們還應(yīng)該引入實驗動物模型來分析IL-1β和電磁場對骨折愈合的具體作用，為將來電磁場的臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。