酶制劑在柿子醋傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用研究

陳書(shū)明，張晶

(三門(mén)峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，三門(mén)峽市生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 三門(mén)峽 472000)

柿子是我國(guó)重要的特色水果之一，其產(chǎn)量?jī)H次于蘋(píng)果、梨、葡萄，位居第四位。柿樹(shù)在黃河流域的陜西、河南、河北及山西栽培最多[1]，占全國(guó)產(chǎn)量的70%～80%。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年的柿子產(chǎn)量排在世界首位，但是國(guó)際貿(mào)易金額不到全球貿(mào)易總額的3%[2]。我國(guó)柿子加工還停留在傳統(tǒng)加工工藝階段，柿餅和柿子醋是主要的加工產(chǎn)品。

隨著生活水平的提高和人們對(duì)柿子中各種成分和藥用價(jià)值的進(jìn)一步了解，柿子醋逐步從調(diào)味品轉(zhuǎn)變?yōu)槿藗冄壑械谋＝∑?。目前，因生產(chǎn)成本和產(chǎn)品品質(zhì)等原因，柿子醋生產(chǎn)主要依靠傳統(tǒng)發(fā)酵工藝。河南省三門(mén)峽及周邊地區(qū)的窯藏發(fā)酵工藝生產(chǎn)的柿子醋品質(zhì)好，但發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、出汁率低、品質(zhì)不均一，無(wú)法進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。酶制劑作為生物制劑，在食品加工中廣泛應(yīng)用，但復(fù)合酶制劑在柿子醋生產(chǎn)中的應(yīng)用鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以柿子為原料，模擬窯藏柿子醋的發(fā)酵環(huán)境，通過(guò)添加多種酶制劑來(lái)改善傳統(tǒng)發(fā)酵工藝生產(chǎn)柿子醋中存在的問(wèn)題，為其規(guī)?；a(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)，以期獲得發(fā)酵時(shí)間短、出汁率高、品質(zhì)兼優(yōu)的柿子醋。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柿子：產(chǎn)自三門(mén)峽陜縣；半纖維素酶、糖化酶、果膠酶、β-甘露聚糖酶：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；氫氧化鈉：洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F160全溫度振蕩培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市華美生化儀器廠；PHS-3C數(shù)顯酸度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；VAL-1N 酒精計(jì) 河北省武強(qiáng)縣阜陽(yáng)儀表廠；PAL-1型手持糖度計(jì) ATAGO公司;UV-1100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

酶解

↓

柿子→挑選→清洗→脫澀→切分→發(fā)酵→過(guò)濾→裝瓶→殺菌→成品。

脫澀：將成熟的新鮮柿子放置于38 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中24 h，完成脫澀。

切分：脫澀后用刀切成3～4 cm的小塊。過(guò)小的柿子從中間縱切1次。

酶解：在切分后的柿子塊中添加單一酶制劑或復(fù)合酶制劑，酶制劑的濃度為0.05 g/mL。

發(fā)酵：放置于26 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每天測(cè)定酸含量，當(dāng)處理樣品的70%～80%酸度值在3.0 mol/L以上時(shí)停止發(fā)酵。

過(guò)濾：雙層尼龍窗紗過(guò)濾。

殺菌：在80 ℃煮15 min。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究進(jìn)行柿子醋生產(chǎn)時(shí)是模擬三門(mén)峽當(dāng)?shù)氐膫鹘y(tǒng)發(fā)酵方式，環(huán)境條件比較恒定，故對(duì)酶制劑的使用溫度和pH值不進(jìn)行優(yōu)化，只考慮酶制劑的使用量對(duì)產(chǎn)品的影響。半纖維素酶(2×105U/g)、糖化酶(1×105U/g)、果膠酶(1×105U/g)、β-甘露聚糖酶(6×104U/g)的用量分別設(shè)定為1.0，2.0,2.0，3.0 g/kg，試驗(yàn)中將各種酶制劑配制成一定濃度的酶溶液，然后按梯度要求添加到切分后的柿子中，對(duì)照組內(nèi)不加酶制劑。通過(guò)測(cè)定樣品的吸光度值來(lái)檢測(cè)酶處理效果，雖然酶產(chǎn)于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程，考慮到發(fā)酵后柿子醋內(nèi)菌體會(huì)影響到吸光度值，所以吸光度值在發(fā)酵前進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定吸光度時(shí)，每份樣品添加兩份水。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照1.3.1的工藝，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上各取 3 個(gè)水平進(jìn)行 L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，正交設(shè)計(jì)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 正交設(shè)計(jì)因素和水平 Table 1 Factors and levels of orthogonal design g/kg

1.3.4 檢測(cè)方法

對(duì)樣品處理后，取樣品中液體經(jīng)4層紗布過(guò)濾后測(cè)定理化指標(biāo)。固形物含量：采用糖度儀測(cè)定；pH值：采用pH計(jì)測(cè)定；酸度值：采用滴定法測(cè)定；吸光度值：采用紫外分光光度儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 半纖維素酶添加量對(duì)柿子汁的影響

自然界中，半纖維素是第二大雜聚物，由雜聚多糖聚合而成，是植物體的主要成分之一。每種植物的半纖維素往往含有幾種由兩種或三種糖基構(gòu)成的含有500～3000個(gè)糖單位的大分子多糖，植物組織中大量半纖維素以共價(jià)鍵連接到果膠或以氫鍵連接到纖維素上[3]。半纖維素很不穩(wěn)定，在酸性環(huán)境下較纖維素易于水解成單體。

圖1 半纖維素酶對(duì)柿子汁吸光度值的影響Fig.1 Effect of hemicellulase on absorbance value of persimmon juice

由圖1可知，與對(duì)照相比，添加半纖維素酶后，在24 h內(nèi)處理組柿子汁的吸光度值均低于對(duì)照組，但處理的前20 h，半纖維素酶添加量越大，吸光度值越大。這說(shuō)明柿子汁的吸光度值是果汁的原有成分和半纖維素分解產(chǎn)物共同作用的結(jié)果，半纖維素酶添加量越大，底物的分解速度越快。添加量為1.0 g/kg時(shí)，吸光度值呈上升趨勢(shì)，添加量為2.0，3.0 g/kg時(shí)呈先升高達(dá)到最大值后保持穩(wěn)定的趨勢(shì)，3種添加量在處理24 h時(shí)吸光度值幾乎一樣。說(shuō)明添加這3種劑量的半纖維素酶，在24 h均能把樣品內(nèi)的半纖維素徹底分解。因?yàn)槊钢苿┐嬖谟谡麄€(gè)發(fā)酵過(guò)程中，考慮到成本因素和半纖維素酶對(duì)柿子醋品質(zhì)的影響，半纖維素酶的最佳添加劑量確定為1.0 g/kg。

2.2 糖化酶添加量對(duì)柿子汁的影響

糖化酶能把淀粉從非還原性末端水介α-1,4葡萄糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖，也能緩慢水解α-1,6葡萄糖苷鍵，轉(zhuǎn)化為葡萄糖。一直以來(lái)，因糖化酶能提高酒的出汁率，其被廣泛用于各類(lèi)酒的生產(chǎn)。

由圖2可知，添加糖化酶后，處理組樣品的吸光度值低于對(duì)照組；相同處理時(shí)間添加量越大，吸光度值降低越多；處理時(shí)間越長(zhǎng)，吸光度值降低越多。在24 h內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的處理組間吸光度值差值幾乎相同，如處理16 h添加1.0 g/kg比添加2.0 g/kg吸光度值大0.081，處理20 h為0.102，處理24 h為0.122。說(shuō)明在測(cè)定的有限時(shí)間段內(nèi)，底物的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶制劑的量，這可能是因?yàn)樵谠撎幚頊囟认绿腔富盍^(guò)低導(dǎo)致的。因此，糖化酶的最佳添加量是3.0 g/kg。

圖2 糖化酶對(duì)柿子汁吸光度值的影響Fig.2 Effect of glucoamylase on absorbance value of persimmon juice

2.3 果膠酶添加量對(duì)柿子汁的影響

柿子富含果膠物質(zhì)，果膠物質(zhì)包括原果膠、果膠和果膠酸，隨著柿子的成熟，原果膠分解，成為可被人體利用的果膠和果膠酸[4]。在果汁加工中,果膠是造成出汁率低的主要因素之一[5]。酶催化反應(yīng)可有效提高果汁的出汁率、澄清度[6，7],提高果汁的品質(zhì)和產(chǎn)量。

圖3 果膠酶對(duì)柿子汁吸光度值的影響Fig.3 Effect of pectinase on absorbance value of persimmon juice

由圖3可知，添加果膠酶后，處理組的吸光度值遠(yuǎn)低于對(duì)照組。這說(shuō)明果膠酶能有效降低果汁的粘稠度，研究中也發(fā)現(xiàn)，果膠酶處理的果汁相較于其他單一酶制劑透明度要好。添加1.0 g/kg果膠酶，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)吸光度值呈先降低后穩(wěn)定趨勢(shì)，處理16 h時(shí)吸光度值與添加2.0 g/kg和3.0 g/kg一致；添加2.0 g/kg和3.0 g/kg的果膠酶處理1 h后，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品的吸光度值沒(méi)有差異。這說(shuō)明添加2.0 g/kg和3.0 g/kg的果膠酶能在1 h內(nèi)分解完柿子樣品中的果膠，添加1.0 g/kg時(shí)需要的時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)。果膠酶的處理效果好，除去酶制劑本身因素外，還可能是因?yàn)檠芯恐胁捎玫氖磷颖旧沓墒於缺容^高，又經(jīng)過(guò)較高溫度處理，樣品內(nèi)果膠含量減少引起的。因?yàn)楣z酶處理果汁后，并不對(duì)果膠酶滅活，其參與柿子的發(fā)酵過(guò)程，因此果膠酶的最佳添加量是1.0 g/kg。

2.4 β-甘露聚糖酶添加量對(duì)柿子汁的影響

甘露聚糖在植物組織里分布廣泛，是一種線性多糖。其散狀分布于木質(zhì)素和纖維素之下，而且它將木質(zhì)素與纖維絲條下不同位置上通過(guò)氫鍵共價(jià)結(jié)合形成包被。這個(gè)過(guò)程中氫鍵較少，所以比纖維素更容易受到破壞[8]。β-甘露聚糖酶是水解甘露聚糖的主要酶，攻擊甘露聚糖主鏈內(nèi)部的糖苷鍵，釋放短的β-1,4-甘露低聚糖。添加β-甘露聚糖酶后，樣品的吸光度值變化情況見(jiàn)圖4。

圖4 β-甘露聚糖酶對(duì)柿子汁吸光度值的影響Fig.4 Effect of β-mannanase on absorbance value of persimmon juice

由圖4可知，所有處理組吸光度值均低于對(duì)照組，說(shuō)明β-甘露聚糖酶在該處理溫度、pH值等環(huán)境條件下具有活性。隨時(shí)間延長(zhǎng)，添加1.0 g/kg β-甘露聚糖酶吸光度值呈現(xiàn)先降低再升高后又降低的趨勢(shì)，添加2.0 g/kg吸光度值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，添加3.0 g/kg吸光度值呈現(xiàn)先降低后保持相對(duì)穩(wěn)定的趨勢(shì)。說(shuō)明添加3.0 g/kg β-甘露聚糖酶處理16 h后，樣品內(nèi)的甘露聚糖幾乎被分解完全，而添加1.0，2.0 g/kg β-甘露聚糖酶在處理24 h時(shí)樣品內(nèi)的甘露聚糖還沒(méi)有分解完，但是添加1.0 g/kg與添加2.0 g/kg差別不明顯?？紤]到酶處理后還有較長(zhǎng)的發(fā)酵周期及成本問(wèn)題，β-甘露聚糖酶的最佳添加量為1.0 g/kg。

2.5 復(fù)合酶制劑對(duì)柿子汁和柿子醋的影響

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)半纖維素酶、糖化酶、果膠酶、β-甘露聚糖酶4種酶進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。酶有協(xié)同增效作用，正交試驗(yàn)時(shí)每種酶的最大添加量為單一使用的最佳添加量?？紤]到采用單一酶制劑對(duì)樣品進(jìn)行處理時(shí)，糖化酶和β-甘露聚糖酶在處理24 h時(shí)沒(méi)有將底物分解完，所以在正交試驗(yàn)時(shí)處理時(shí)間增加到28 h，溫度不變。在此環(huán)境下，會(huì)有一定微生物的繁殖，影響吸光度值，為了增加試驗(yàn)結(jié)果的可信度，測(cè)定樣品吸光度值的同時(shí)，還需測(cè)定樣品的可溶性固形物含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及綜合評(píng)價(jià)結(jié)果 Table 2 Orthogonal experimental design and comprehensive evaluation results

由表2可知，對(duì)樣品的吸光度值來(lái)說(shuō)，這4種酶制劑的影響程度依次為：D>B>C>A；這4種酶制劑對(duì)可溶性固形物含量的影響程度也為D>B>C>A，β-甘露聚糖酶對(duì)樣品的吸光度值和可溶性固形物含量影響最大，其次是糖化酶。酶制劑添加量越大，處理效果越好，單因素試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，半纖維素酶和β-甘露聚糖酶添加量越大，吸光度值越大；糖化酶和果膠酶添加量越大，吸光度值越小，因此在選擇復(fù)合酶制劑的最優(yōu)方案時(shí)不能從9組處理方式中直接挑選出來(lái)。最優(yōu)方案應(yīng)該按照單一酶制劑對(duì)吸光度值的影響規(guī)律進(jìn)行逐個(gè)挑選。半纖維素酶添加量越大，吸光度值越大，故其最佳濃度是k1對(duì)應(yīng)的添加量0.6 g/kg，同理，β-甘露聚糖酶為0.6 g/kg；糖化酶添加量越大，吸光度值越小，因此其最佳添加量為k3對(duì)應(yīng)的3.0 g/kg，同理，果膠酶為0.7 g/kg。

在本研究中，因?yàn)槟M傳統(tǒng)發(fā)酵工藝的環(huán)境，但是又添加了酶制劑，發(fā)酵時(shí)間不能精確確定。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)定，處理樣品的正交試驗(yàn)共有9個(gè)處理組，當(dāng)7組的酸度值在3.0 mol/L以上時(shí)停止發(fā)酵。本研究的發(fā)酵時(shí)間為25 d。發(fā)酵結(jié)束測(cè)定出醋率和醋的酸含量，結(jié)果見(jiàn)表2。影響出醋率和醋酸含量的4種酶制劑主次因素排序均是B>D>C>A，糖化酶對(duì)樣品的出醋率和醋酸含量影響最大，其次是β-甘露聚糖酶。對(duì)照組出醋率為52%，酶制劑能提高柿子醋的出醋率。

由表2結(jié)果可知，糖化酶和β-甘露聚糖酶是影響柿子汁吸光度值和可溶性固形物含量及柿子醋的出醋率和酸含量的主要因素，半纖維素酶的影響最小。糖化酶因可以提高酒的出汁率和節(jié)省成本一直被廣泛用于各類(lèi)酒的生產(chǎn)，本研究結(jié)果顯示，柿子醋的生產(chǎn)過(guò)程添加該酶制劑也能起到很好的效果。β-甘露聚糖酶應(yīng)用于果汁或果醋的生產(chǎn)鮮有報(bào)道，但本研究中發(fā)現(xiàn)添加該酶制劑也能取得較好效果，這可能是因?yàn)槭磷觾?nèi)半纖維的構(gòu)成中甘露糖所占比例較大。半纖維素酶因是由木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶等酶構(gòu)成的復(fù)合酶，每種酶都有自己最合適的底物，如果其中一種或多種酶所需的底物不存在或者數(shù)量少，就會(huì)影響到復(fù)合酶的效果。正交試驗(yàn)中半纖維素酶的影響小可能就是該原因造成的。對(duì)照組的酸含量為1.27 mol/L，復(fù)合酶制劑處理組酸含量遠(yuǎn)大于對(duì)照組，說(shuō)明酶處理能加速柿子醋的發(fā)酵。

3 結(jié)論

本研究以柿子為主要原料，研究半纖維素酶、糖化酶、果膠酶及β-甘露聚糖酶不同添加量對(duì)柿子汁品質(zhì)和柿子醋出醋率及酸含量的影響，采用單因素試驗(yàn)以及正交優(yōu)化試驗(yàn)， 探究單一酶制劑和復(fù)合酶制劑的最佳使用量。酶制劑單一使用時(shí)，最佳組合為半纖維素酶1.0 g/kg、糖化酶3.0 g/kg、果膠酶1.0 g/kg、β-甘露聚糖酶1.0 g/kg；復(fù)合使用時(shí)，最佳組合為半纖維素酶0.6 g/kg、糖化酶3.0 g/kg、果膠酶0.7 g/kg、β-甘露聚糖酶0.6 g/kg。復(fù)合酶制劑添加到柿子醋的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝中，能提高柿子的出醋率；能把生產(chǎn)周期由原來(lái)的3～10個(gè)月縮短為25 d；柿子醋顏色為淡黃色，比傳統(tǒng)的褐色保留了較多的營(yíng)養(yǎng)成分，但是柿子醋的柿子固有香氣弱，酸味不柔和。