龍道國，徐細(xì)明

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院/湖北省人民醫(yī)院腫瘤科，湖北武漢 431900)

結(jié)直腸癌是許多國家發(fā)病率和病死率的主要原因，盡管近年來其發(fā)病率在世界發(fā)展中國家增加，但在較發(fā)達(dá)國家更嚴(yán)重[1]。目前，絲裂霉素C是最常用于加熱腹腔內(nèi)化療的化學(xué)治療劑[2]，是一種具有抗腫瘤活性的天然抗菌藥物，已被用于多種實(shí)體腫瘤，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞癌和膀胱癌[3]。WU等[4]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1的表達(dá)水平和磷酸化水平與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。SHEN等[5]研究發(fā)現(xiàn)，絲裂霉素C能調(diào)控腫瘤細(xì)胞中蛋白的磷酸化水平。本研究旨在探討絲裂霉素C、FOXO1磷酸化與結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和活力的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 絲裂霉素C購自北京百奧萊博科技有限公司(貨號(hào)：BP1618-KWB)。HA-Foxo1-WT和HA-Foxo1-MT的質(zhì)粒購自北京中原公司(ADDGNE貨號(hào)：#10693、#9025)。HA、FOXO1A(phospho S256)、FOXO1A、TUBULIN抗體購自Abcam公司(貨號(hào)：ab18181、ab131339、ab39670、ab32124)。結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116購自上海子實(shí)生物科技有限公司(貨號(hào)：Qs101092)。RPMI培養(yǎng)基購自上海優(yōu)予生物科技有限公司(貨號(hào)：lffs1847)，胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司(貨號(hào)：10099-133)。蛋白酶抑制劑Cocktail (不含EDTA,mini片劑) 購自Bbimake公司(貨號(hào)：B14011)。PBS購自生工生物工程(上海)股份有限公司(貨號(hào)：E607008)。青鏈霉素混合液(100×)購自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào)：P1400)。2×十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白電泳上樣緩沖液購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司(貨號(hào)：WB-0081)。蛋白裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：P0013)。NanoFect轉(zhuǎn)染試劑購自南通柯侎克生物科技有限公司(貨號(hào)：NF100)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、藥物處理和轉(zhuǎn)染 結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116維持在補(bǔ)充有2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和10%熱滅胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并在潮濕氣氛(37 ℃，5%CO2)中培養(yǎng)。絲裂霉素C以終濃度0.5 μg/mL處理結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116。通過NanoFect轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞。將含HA-Foxo1-WT和HA-Foxo1-MT質(zhì)粒分別與脂質(zhì)體混合，靜止大約20 min后，緩緩滴入HCT116細(xì)胞。選用結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116，PBS處理的HCT116為對(duì)照組，絲裂霉素C處理的HCT116為絲裂霉素C處理組，HA-Foxo1-WT轉(zhuǎn)染的HCT116為FOXO1-WT組，HA-Foxo1-MT轉(zhuǎn)染的HCT116為FOXO1-MT組，每組3例。

1.2.2免疫印跡 行10%或12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。將PVDF膜在室溫下用5%脫脂奶粉的Tris緩沖液封閉1 h，然后在4 ℃下與HA、FOXO1A (phospho S256)、FOXO1A、TUBULIN抗體溫育過夜。然后將膜在室溫下與綴合有HRP的相應(yīng)二抗孵育1 h。觀察特定蛋白質(zhì)使用ECL Plus 免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)。

1.2.3MTT試驗(yàn) 第1天使用胰蛋白酶消化HCT116細(xì)胞，將HCT116細(xì)胞稀釋至每毫升75 000個(gè)細(xì)胞,使用完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞。根據(jù)MTT試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.2.4CCK-8試驗(yàn) 在96孔板中分配100 μL HCT116細(xì)胞懸浮液(每孔5 000個(gè)細(xì)胞)。將板在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)孵育24 h。根據(jù)CCK-8試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1絲裂霉素C抑制HCT116細(xì)胞的增殖和活力 用絲裂霉素C處理細(xì)胞后，與對(duì)照相比，MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，在第2天和第3天結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116的增殖受到明顯的抑制(t=8.023,P=0.016;t=6.814,P=0.021)；同時(shí)，CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，第2天、第3天和第4天的細(xì)胞活力受到明顯的抑制(t=8.472,P=0.014;t=13.887，P=0.007；t=2.943,P=0.042)。見圖1、2。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖1絲裂霉素C抑制HCT116細(xì)胞增殖

2.2絲裂霉素C抑制FOXO1磷酸化 用絲裂霉素C處理細(xì)胞后，與對(duì)照相比，免疫印跡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中FOXO1的總量無明顯差異，但是S256位點(diǎn)的磷酸化FOXO1的蛋白量明顯減少(t=4.801，P=0.039)，見圖3。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖2絲裂霉素C抑制HCT116細(xì)胞活力

圖3 絲裂霉素C抑制FOXO1磷酸化

圖4 FOXO1-WT和FOXO1-MT的表達(dá)

圖5 轉(zhuǎn)染FOXO1-WT和FOXO1-MT后HCT116細(xì)胞的增殖情況

注：2組比較，*P<0.05

圖6絲裂霉素C通過抑制FOBO1磷酸化抑制HCT116細(xì)胞的增殖

2.3絲裂霉素C通過抑制FOBO1磷酸化抑制HCT116細(xì)胞的增殖和活力 分別轉(zhuǎn)染HA-FOXO1-WT和HA-FOXO1-MT，HCT116細(xì)胞的增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.079，P=0.77)。同時(shí)用絲裂霉素C處理，發(fā)現(xiàn)FOXO1-WT組的細(xì)胞增殖在第2天和第3天均明顯小于FOXO1-MT組(t=4.926,P=0.031;t=7.037，P=0.019)；FOXO1-WT組的HCT116的細(xì)胞活力在第3天和第4天均明顯小于FOXO1-MT組(t=14.089,P=0.005;t=13.741，P=0.008)。見圖4～7。

注：與FOXO1-WT組比較，*P<0.05

圖7絲裂霉素C通過抑制FOBO1磷酸化抑制HCT116細(xì)胞的活力

3 討 論

據(jù)報(bào)道，結(jié)直腸癌是全球第3大常見癌癥，2012年診斷出136萬人[6]。結(jié)直腸癌的預(yù)后與診斷有關(guān)，早期診斷時(shí)的5年生存率為90%，結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移診斷時(shí)的生存率低于10%[7]。目前的治療藥物選擇包括絲裂霉素C、5-氟尿嘧啶、伊立替康、奧沙利鉑、替加氟-尿嘧啶/亞葉酸鈣和5-氟尿嘧啶前藥卡培他濱[8]。此外，最近將貝伐單抗、西妥昔單抗和帕尼單抗納入治療組合方案中[9]。然而，新的治療方案以增加毒性為代價(jià)改善了預(yù)后，并且患有轉(zhuǎn)移性疾病的患者最終將對(duì)可用藥物產(chǎn)生耐藥性，且其分子機(jī)制并未明確。因此，闡明分子機(jī)制和開發(fā)新的、有效的、毒性較小的藥物已成為當(dāng)務(wù)之急。

FOXO1是FOX轉(zhuǎn)錄因子O亞家族的成員[10]。FOXO1與FOXO3、FOXO4等其他成員一起參與細(xì)胞周期退出和G1停滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、氧化和細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)[11]。在本研究中，當(dāng)細(xì)胞被絲裂霉素C處理后，發(fā)現(xiàn)磷酸化的FOXO1的表達(dá)被下調(diào)(P<0.05)。細(xì)胞中的FOXO1蛋白呈現(xiàn)磷酸化的無活性形式和未受磷酸化的活性形式[12]。因此，磷酸化的FOXO1的表達(dá)被下調(diào)，且未受磷酸化的FOXO1的活性形式被上調(diào)，HCT116的細(xì)胞增殖和活力明顯下降(P<0.05)。FOXO1-MT的突變體是在FOXO1磷酸化位點(diǎn)上進(jìn)行的磷酸化模擬型突變，即FOXO1-MT持續(xù)磷酸化且無法被去磷酸化。分別轉(zhuǎn)染HA-FOXO1-WT和HA-FOXO1-MT，同時(shí)用絲裂霉素C處理，發(fā)現(xiàn)FOXO1-WT組的HCT116的細(xì)胞增殖和活力均明顯小于FOXO1-MT組(P<0.05)。本研究所用的FOXO1-MT的突變?yōu)門24A、S256A和S319A，提示絲裂霉素C調(diào)控的FOXO1磷酸化位點(diǎn)至少有T24、S256、S319中的一個(gè)。FOXO1的磷酸化酶和去磷酸化酶有PKB/AKT1、PKB/AKT2、SGK1、STK4/MST1、CDK1[13]，提示絲裂霉素C可能影響這些磷酸化酶的轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平或酶活性來抑制其功能。而僅分別轉(zhuǎn)染HA-FOXO1-WT和HA-FOXO1-MT，HCT116的細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示在HCT116細(xì)胞中FOXO1處于高度磷酸化的無活性形式。而用絲裂霉素C處理后，野生型的FOXO1發(fā)生去磷酸化。因此，相比于持續(xù)磷酸化且無法被去磷酸化的FOXO1突變型，表達(dá)野生型的FOXO1的HCT116細(xì)胞的增殖和細(xì)胞活力明顯降低。隨著未磷酸化的FOXO1增加，蛋白質(zhì)FOXO1易于進(jìn)入細(xì)胞核[14]。因此，絲裂霉素C處理HCT116細(xì)胞后，入核的轉(zhuǎn)錄因子FOXO1對(duì)各種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，包括p27Kip1、p130-Rb2和細(xì)胞周期蛋白D1/2(細(xì)胞周期調(diào)節(jié))，腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)，進(jìn)而抑制HCT116的增殖和細(xì)胞活力[15-17]。

綜上所述，絲裂霉素C通過抑制FOXO1磷酸化來降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和活力。