HPLC法測定知柏地黃丸中毛蕊花糖苷的含量

李騰 湯瑩*

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430030）

知柏地黃丸系中藥成方制劑，由熟地黃、知母、黃柏、山茱萸（制）、山藥、牡丹皮、茯苓、澤瀉8味中藥組成，具有滋陰清熱的功效。用于陰虛火旺，潮熱盜汗，口干咽痛，耳鳴遺精，小便短赤。該制劑選藥精當，力有所專，補泄均衡，配伍嚴謹，臨床應(yīng)用廣泛，療效確切。制劑質(zhì)量標準執(zhí)行《中華人民共和國藥典》（2015版）標準，標準中除常規(guī)檢查和理化鑒別外，對制劑中的馬錢苷（來源于山茱萸）和丹皮酚（來源于牡丹皮）含量設(shè)定了質(zhì)控限值。制劑中熟地黃是方中主藥，具有補血滋陰，益精填髓等功效，指標成分為毛蕊花糖苷，臨床上應(yīng)用較為廣泛，用于血虛萎黃、心悸怔忡、月經(jīng)不調(diào)、崩漏下血、肝腎陰虛、腰膝酸軟、骨蒸潮熱、盜汗遺精、內(nèi)熱消渴、眩暈耳鳴、須發(fā)早白等［1-4］。我們查閱文獻了解到，目前雖有知柏地黃丸臨床療效及質(zhì)量控制相關(guān)的研究報道［5-6］，但尚未有對毛蕊花糖苷進行含量限值控制的相關(guān)研究報道。為了進一步完善知柏地黃丸的質(zhì)量標準［7］，本文建立了HPLC法測定知柏地黃丸的毛蕊花糖苷含量的方法，方法簡便快速、準確度高、專屬性強，可用于知柏地黃丸中毛蕊花糖苷的測定，為提高知柏地黃丸質(zhì)量標準提供借鑒。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；超聲波清洗器（KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；賽多利斯BP211D電子分析天平（德國賽多利斯股份公司）；RC806型溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）

1.2 藥品與試劑 毛蕊花糖苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111530-201713）；知柏地黃丸（北京某廠（批號：180826、180908、180919）；知母、黃柏、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓和澤瀉藥材（均購自安徽天馬中藥飲片科技有限公司）；乙腈，甲醇為色譜純（美國Merck公司）；其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流動相：乙腈-0.1% 乙酸溶液（13∶87，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：334 nm；柱溫：33℃；進樣量：10 μL［8-10］。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷對照品2.08 mg，用流動相為溶劑制成10 mL的毛蕊花糖苷溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研碎，過6號篩，取約1 g，精密稱定，置于棕色容量瓶中，精密加入50% 甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，浸泡30 min，超聲（功率：50 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足差重，搖勻，過濾，精密吸取25 mL續(xù)濾液，置于恒溫水浴鍋60℃下?lián)]干，殘渣加流動相定容至5 mL，過0.45 μm濾膜，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取處方中除熟地黃外的其余藥味，按知柏地黃丸的制法制備不含熟地黃的陰性對照制劑，按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 陰性干擾試驗 取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜，見圖1。由圖1可見，毛蕊花糖苷峰相應(yīng)的位置未見其他的干擾峰出現(xiàn)。

圖1 高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取毛蕊花糖苷對照品適量，精密吸取上述對照品溶液 （208 μg/mL）0.25、0.5、1、2.5、5 mL置于10 mL的容量瓶中，用流動相定容至刻度線，加上母液共配制成6個濃度對照品溶液，進樣量均為10 μL，以進樣濃度（mg/mL）為橫坐標，峰面積值為縱坐標繪制標準曲線，計算的線性方程為y=226.13×x-1.0111，r=0.9998。結(jié)果表明，毛蕊花糖苷在5.2×10-3～208×10-3mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按照“2.1”項下的色譜條件重復(fù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果，毛蕊花糖苷峰面積的RSD＝0.92%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：180826） 適量，分別于放置0、4、8、12、20、24 h時精密吸取10 μL，注入HPLC儀，按“2.1”項下色譜條件進樣測定峰面積。結(jié)果，毛蕊花糖苷峰面積的RSD＝1.18%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 取樣品（批號：180826）適量，共6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定毛蕊花糖苷的峰面積并計算含量。結(jié)果，毛蕊花糖苷含量的RSD＝1.37%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品（0.906 6 mg/g）約1.0 g，分別精密加入低、中、高不同量的對照品六份，編號，然后按上述方法，最后稀釋至25 mL，制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件測定含量，計算回收率，結(jié)果平均回收率為97.4%，RSD=1.28%，表明本方法可靠，見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.9 樣品含量測定 分別取知柏地黃丸3批各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，計算含量。結(jié)果3批樣品中毛蕊花糖苷平均含量分別為0.25、0.28、0.26 mg/丸。以80%的轉(zhuǎn)移率計，制劑中毛蕊花糖苷不應(yīng)少于0.21 mg/丸。

3 討論

3.1 提取方法的選擇 本實驗預(yù)實驗時比較了純水、50%乙醇和75%乙醇三種提取溶劑，結(jié)果表明三種溶劑均能將毛蕊花糖苷提取完全，結(jié)合干膏得率和經(jīng)濟效益，最終采用50%乙醇做提取溶劑。比較了25、50，75，100倍提取溶劑的提取效率，結(jié)果表明50倍，75倍和100倍取溶劑的提取效率沒有顯著性差異，最終采用50倍提取容積提取。同時考察了超聲波提取時間，最終確定超聲波提取30 min。因此最終確定提取方法為：用50倍50%乙醇，超聲波提取30 min。采用本法提取知柏地黃丸中的毛蕊花糖苷，準確可靠。

3.2 流動相的選擇 本實驗同期曾采用乙腈∶純水、甲醇∶純水和甲醇∶0.1%乙酸溶液作為流動相，同時考察了不同比例對色譜的影響，但實驗結(jié)果顯示要么雜質(zhì)峰過多而目標峰不明顯，要么峰形拖尾均嚴重。經(jīng)過對比，結(jié)果表明采用乙腈-0.1% 乙酸溶液 （13∶87，V/V） 作為流動相，樣品峰型最為穩(wěn)定，雜質(zhì)峰較少，保留時間適宜，靈敏度高，可為相關(guān)制劑中毛蕊花糖苷的含量測定提供一種新方法。

3.3 本研究的價值 中藥制劑質(zhì)量標準中的含量測定項首選君藥，熟地黃為知柏地黃丸方中君藥，其指標成分毛蕊花糖苷，應(yīng)當設(shè)立毛蕊花糖苷為標準中含量測定項，參考本實驗結(jié)果，建議知柏地黃丸中熟地黃含量以毛蕊花糖苷計不應(yīng)少于0.21 mg/丸。本實驗方法可快速測量知柏地黃丸中毛蕊花糖苷的含量，方法簡便、結(jié)果準確、靈敏度高、重復(fù)性好，可為進一步提高知柏地黃丸的質(zhì)量控制提供借鑒，同時可也為其他中成藥制劑中熟地黃的質(zhì)量控制提供參考。