強(qiáng)脈沖光與長(zhǎng)脈寬Nd:YAG激光對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響

朱雅琳 聶晶 帕麗達(dá)·阿布利孜

[摘要]目的：從分子生物學(xué)水平探討強(qiáng)脈沖光和長(zhǎng)脈寬1 064nm Nd：YAG激光治療血管瘤的機(jī)制。方法：使用不同能量強(qiáng)脈沖光和長(zhǎng)脈寬1 064nm Nd：YAG激光對(duì)嬰兒血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外照射，照射后測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞OD值，并進(jìn)行比較。結(jié)果：強(qiáng)脈沖光組照射后，在同一時(shí)間點(diǎn)能量越高，體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞OD值越低，表明照射后存活細(xì)胞數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在所有測(cè)試時(shí)間點(diǎn)均呈現(xiàn)相同的改變趨勢(shì)。Nd：YAG組照射后，在同一時(shí)間點(diǎn)，不同能量顯示相同的變化趨勢(shì)。在同一能量組，不同時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)有所不同。結(jié)論：強(qiáng)脈沖光和Nd：YAG激光對(duì)于血管瘤的抑制作用除了“選擇性光熱作用”外，還通過(guò)影響血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮抑制作用，并且影響程度在一定范圍內(nèi)受到能量和時(shí)間的影響。

[關(guān)鍵詞]強(qiáng)脈沖光;Nd：YAG激光;嬰兒血管瘤;內(nèi)皮細(xì)胞;體外培養(yǎng);生長(zhǎng)曲線

[中圖分類(lèi)號(hào)]R732.2? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2019）09-0096-06

1983年Anderson和Parish提出了“選擇性光熱作用”理論[1-2]，對(duì)激光的臨床應(yīng)用起到革命性的作用。此后激光成功用于血管瘤的治療中，并取得明顯成效。激光將血液加熱到70℃左右導(dǎo)致血管的不可逆性破壞，從而達(dá)到治療目的。強(qiáng)脈沖光源是由高能量的閃光燈激發(fā)出波長(zhǎng)515～1 200nm的非相干光，也通過(guò)“選擇性光熱作用原理”對(duì)血管瘤發(fā)揮治療作用，可變脈寬1 064nm Nd：YAG激光在嬰兒血管瘤的治療中也取得較好的臨床應(yīng)用[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)普萘洛爾對(duì)體外培養(yǎng)的嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，同時(shí)對(duì)相關(guān)生長(zhǎng)因子、β-腎上腺素受體及細(xì)胞凋亡均有影響[4-10]，那么強(qiáng)脈沖光和激光除了通過(guò)“選擇性光熱作用原理”起到治療嬰兒淺表血管瘤的作用外，是否通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性而起到治療作用，還有待研究。本研究擬通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行強(qiáng)脈沖光和長(zhǎng)脈寬1 064nm Nd：YAG激光照射，分別觀察照射前后血管瘤內(nèi)皮生長(zhǎng)曲線及形態(tài)學(xué)的變化，從分子生物學(xué)水平探討強(qiáng)脈沖光和長(zhǎng)脈寬1 064nm Nd：YAG激光治療血管瘤的機(jī)制。

1? 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源于前期實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)的嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的倫理審查，并且體外培養(yǎng)的嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)免疫組化進(jìn)行鑒定，進(jìn)行了純度測(cè)定（為75%）。

1.2 主要試劑：胎牛血清（FBS）（美國(guó)Life technologies公司，16000044）;EGM-2（CC-4176，Lonza）;0.25%胰酶（Trypsin-EDTA）（25200-056，Gibco）;PBS磷酸鹽緩沖液粉劑（ZLI-9062，北京中杉金橋生物）;青霉素-鏈霉素雙抗（10000U）（SC30010，Gibco）;CCK-8試劑（FC101-03，北京全式金生物）

1.3 方法

1.3.1 試劑配制：2%血清EGM-2完全培養(yǎng)基：500ml的EGM-2培養(yǎng)基中含10ml胎牛血清、0.2ml醋酸氫化可的松、hFGF-b 2ml、VEGF 2ml、R3-IGF-1 0.5ml、抗壞血酸0.5ml、hEGF 0.5ml、GA-1000 0.5ml、肝素0.5ml，添加1ml的青-鏈霉素雙抗溶液。10% DMSO細(xì)胞凍存液：0.1ml的DMSO溶液加入0.9ml的完全培養(yǎng)基中。10% CCK-8溶液配制：按照CCK-8與完全培養(yǎng)基1：9比例配制10% CCK-8檢測(cè)溶液。

1.3.2 細(xì)胞準(zhǔn)備：從液氮中取出凍存的前期實(shí)驗(yàn)進(jìn)行原代培養(yǎng)并鑒定的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)行復(fù)蘇及傳代。當(dāng)培養(yǎng)瓶（25cm2）中細(xì)胞貼壁融合達(dá)80%時(shí)，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，完全培養(yǎng)基制備成0.2～1×105 cells/ml單細(xì)胞懸液，每隔24h接種至96孔板中（100μl/孔，6個(gè)復(fù)孔，即0.2～1×104個(gè)細(xì)胞/孔）。8d后小心吸干凈細(xì)胞培養(yǎng)基，加入配置好的10% CCK-8溶液，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育，1～4h后酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。（取合適的檢測(cè)時(shí)間OD值進(jìn)行計(jì)算，一般選取OD值為1～2的值進(jìn)行計(jì)算）。繪制生長(zhǎng)曲線，確定細(xì)胞株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 不同能量激光照射體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞：共分為七組。

1.3.3.1 激光分組照射情況：空白對(duì)照組：不照射，只使用2%血清EGM-2完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。強(qiáng)脈沖光照射組（intense pulsed light）：照射波長(zhǎng)為560nm，雙脈沖，脈寬3.5ms，脈沖間隔20ms，其中A組照射能量為23J/cm2，B組為24J/cm2，C組為25J/cm2。激光照射組（l 064nm Nd：YAG激光）：照射波長(zhǎng)1 064nm，單脈沖，脈沖持續(xù)時(shí)間11.5ms，其中A組能量為90J/cm2，B組為100J/cm2，C組為110J/cm2。

1.3.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制備成0.2～1×105 cells/ml單細(xì)胞懸液，接種至96孔板中（100μl/孔，5個(gè)復(fù)孔，即0.2～1×104個(gè)細(xì)胞/孔）。2種照射方式、每組7個(gè)檢測(cè)時(shí)間段、每個(gè)時(shí)間段5個(gè)重復(fù)，共加7個(gè)96孔板，標(biāo)記好光照能量和檢測(cè)時(shí)間段，將96孔板放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后將96孔板按1.3.3.1中的激光能量分組照射，空白對(duì)照組不進(jìn)行照射。照射后將96孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力：照射后第1、2、3、4、7、14、21天用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。小心吸干凈對(duì)應(yīng)時(shí)間段小孔中的細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入配置好的100μl 10% CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱中37℃孵育1～4h，450nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，平均OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2? 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制結(jié)果：結(jié)果顯示第1～2天細(xì)胞吸光度平均值增長(zhǎng)緩慢，第2～4天迅速增長(zhǎng)，第5天輕度下降，第6～7天達(dá)到平臺(tái)期。與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。見(jiàn)圖1。

2.2 CCK-8檢測(cè)結(jié)果：不同能量強(qiáng)脈沖光及l(fā) 064nm Nd：YAG照射體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞后，不同時(shí)間點(diǎn)使用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞OD值。

2.2.1 強(qiáng)脈沖光照射：強(qiáng)脈沖光560nm，雙脈沖，脈寬3.5ms，脈沖間隔20ms，能量分別為23、24、25J/cm2進(jìn)行照射，照射后第1、2、3、4、7、14、21d用CCK-8法檢測(cè)每組細(xì)胞OD值發(fā)現(xiàn)，在同一時(shí)間點(diǎn)，能量越高，體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞OD值越低，提示經(jīng)過(guò)照射后生存的細(xì)胞減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;并且在所有的測(cè)試時(shí)間點(diǎn)均呈現(xiàn)相同的改變趨勢(shì)。而在同一能量組，空白組的變化與體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線吻合，而23J/cm2照射組照射后第2～3天較第1天OD值有明顯變化，第4、7、21天OD值明顯下降，較第2、3天均下降，但4、7、21d間并無(wú)差異;24J/cm2照射組則有所不同，在照射第2、3、4、7天的OD值變化不大，第14、21天OD值明顯下降。25J/cm2照射組照射后OD值隨時(shí)間變化不大（P>0.05）。多因素方差分析后顯示激光能量及時(shí)間均是細(xì)胞OD值的影響因素（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2.2 不同Nd：YAG激光照射：在同一時(shí)間點(diǎn)，不同能量顯示相同的變化趨勢(shì)，90J/cm2照射組較空白組OD值有所變化，100J/cm2較空白組和90J/cm2照射組的OD值均有下降，而110J/cm2組較100J/cm2組OD值沒(méi)有明顯變化。在同一能量組，不同時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)有所不同，90J/cm2組照射后第2、3、4、7、14、21天的OD值較第1天均有變化，但隨時(shí)間變化，OD值變化不大，在100J/cm2組OD值較空白組的OD值是下降的，隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞的OD值也是逐漸下降的。見(jiàn)表2。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

2.3.1 空白組：血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)傳代24h后觀察，細(xì)胞逐漸貼壁，呈類(lèi)圓形至多角形。生長(zhǎng)2～3d后，數(shù)量逐漸增多。4～5d細(xì)胞逐漸融合，呈多角形，隨后細(xì)胞逐漸成梭形及條索行，部分可見(jiàn)有類(lèi)似血管結(jié)構(gòu)形成。見(jiàn)圖2。

2.3.2 照射后細(xì)胞形態(tài)變化情況：體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)不同激光照射后，細(xì)胞形態(tài)較前有所改變，細(xì)胞形態(tài)較前纖細(xì)，細(xì)胞間距增大，細(xì)胞變稀疏，見(jiàn)圖3～4。

3? 討論

目前多認(rèn)為激光治療嬰兒血管瘤的機(jī)制為“選擇性光熱作用原理”[1]，但隨著嬰幼兒血管瘤發(fā)病機(jī)制研究的深入，尤其是前期研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等的變化在血管瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中起重要作用[4-6，11-15]，因此猜想激光治療嬰兒血管瘤的機(jī)制并不局限于“選擇性光熱作用原理”，激光同時(shí)對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子有著重要的影響作用。

本研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)脈沖光（560nm，雙脈沖，脈寬3.5ms，脈沖間隔20ms）和1 064nm激光對(duì)體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)是有影響的。在不同能量組，不同時(shí)間點(diǎn)體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)有所改變，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞間距增大，變稀疏，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖受到抑制。其次，對(duì)細(xì)胞的OD值進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩種激光干預(yù)均可降低細(xì)胞的OD值，并且在一定能量范圍內(nèi)隨著能量的升高，OD值降低越明顯，說(shuō)明對(duì)細(xì)胞的抑制作用越明顯，并且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值在進(jìn)一步下降。

強(qiáng)脈沖光照射各能量組在第21天時(shí)OD值較第14天變化不大（P>0.05），在25J/cm2照射組，隨著時(shí)間的變化，細(xì)胞OD值較其他能量組變化不大，而其他各組隨著能量增加以及治療時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值均降低，提示強(qiáng)脈沖光照射后血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量減少，生長(zhǎng)被抑制，因此考慮強(qiáng)脈沖光對(duì)體外培養(yǎng)的嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞有抑制作用，其對(duì)血管瘤的治療作用不僅僅是通過(guò)“選擇性光熱作用原理”，也通過(guò)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)而發(fā)揮作用。并且在一定范圍內(nèi)（<25J/cm2）能量越高，抑制作用越強(qiáng)，治療后一定時(shí)間內(nèi)（21d），血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)持續(xù)被抑制的現(xiàn)象，因此推測(cè)激光治療后，除了血紅蛋白吸收激光能量，加熱血管，使血管閉鎖破壞，同時(shí)強(qiáng)脈沖光在治療一段時(shí)間內(nèi)對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞有持續(xù)抑制作用，但是強(qiáng)脈沖光抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。但此結(jié)論提示在臨床治療中，為達(dá)到更好的臨床療效，在一定范圍內(nèi)可提高治療能量，但不能無(wú)限制提高，否則副作用出現(xiàn)增多，且并不能提高療效，其次治療一段時(shí)間后，激光對(duì)細(xì)胞的抑制作用減弱，可再次進(jìn)行治療，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)21d后，強(qiáng)脈沖光組細(xì)胞OD值下降不明顯，因此可以將此時(shí)間作為治療間隔的參考時(shí)間。

Nd：YAG照射組（波長(zhǎng)1 064nm，單脈沖，脈沖持續(xù)時(shí)間11.5ms）：隨著照射后時(shí)間的延長(zhǎng)，鏡下觀察發(fā)現(xiàn) 細(xì)胞間距增大，變稀疏，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖受到抑制。在不同能量組間90～100J/cm2較空白組的OD值變化明顯，說(shuō)明細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，而更高能量組（110J/cm2）則并沒(méi)有顯示出更大的抑制作用，而同一能量組在21d之內(nèi)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，在110J/cm2組，細(xì)胞的生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，而其他組則沒(méi)有明顯的變化趨勢(shì)，但通過(guò)多因素方差分析后，時(shí)間和能量均是細(xì)胞活性的影響因素（P<0.05）。

綜上所述，強(qiáng)脈沖光和長(zhǎng)脈寬Nd：YAG激光對(duì)于體外培養(yǎng)嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)是有影響的，這說(shuō)明強(qiáng)脈沖光和Nd：YAG激光對(duì)于血管瘤的抑制作用除了“選擇性光熱作用”之外，還通過(guò)影響血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)起到抑制作用，并且影響程度在一定范圍內(nèi)受到能量和時(shí)間的影響。因此提示在臨床治療過(guò)程中，在一定范圍內(nèi)可適當(dāng)加大治療劑量以提高療效，也應(yīng)避免過(guò)高能量引起不良反應(yīng)。其次，激光治療后一定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞呈持續(xù)抑制作用，但在一段時(shí)間后（21d），抑制作用呈減弱趨勢(shì)，提示治療可在一定時(shí)間內(nèi)重復(fù)進(jìn)行，但臨床使用還需要進(jìn)一步觀察研究。例如治療需要間隔，給予血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)的時(shí)間。強(qiáng)脈沖光和Nd：YAG激光的這一作用機(jī)制目前尚不清楚，根據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道及研究考慮與細(xì)胞生長(zhǎng)因子，信號(hào)通路有關(guān)，這還需要進(jìn)一步的研究。嬰兒血管瘤的發(fā)病機(jī)制研究并不透徹，但目前的研究顯示，血管瘤發(fā)病機(jī)制是多環(huán)節(jié)，多靶點(diǎn)的，因此提示嬰兒血管瘤的治療除目前的治療方法外，可嘗試多環(huán)節(jié)多靶點(diǎn)的治療，并可考慮綜合治療，以提高血管瘤的治療療效。

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[收稿日期]2018-12-27

本文引用格式：朱雅琳，聶晶，帕麗達(dá)·阿布利孜.強(qiáng)脈沖光與長(zhǎng)脈寬Nd：YAG激光對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2019，28（9）：96-101.