張 璐，馬秋冉，董玲玲，趙富華，楊 星，于曉輝

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

外耳炎是一種犬貓耳道常見疾病，患病動(dòng)物的耳部皮膚會(huì)出現(xiàn)紅斑、脫皮、疼痛和瘙癢癥狀，犬的發(fā)病率在5%～20%之間[1]。近年來有研究表明，氟苯尼考、糠酸莫米松、鹽酸特比萘芬三種成分的復(fù)方獸藥制劑可用于治療犬的外耳炎。但目前多采用高效液相色譜法分別對(duì)氟苯尼考、糠酸莫米松、鹽酸特比萘芬的含量進(jìn)行測(cè)定，尚未見有同時(shí)測(cè)定三種成分的研究報(bào)道。本文擬建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定獸用制劑中氟苯尼考、糠酸莫米松、鹽酸特比萘芬的含量，以期為獸用制劑的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Waters 2695高效液相色譜儀，配置Waters 2489雙通道紫外檢測(cè)器，Empower色譜工作站軟件；電子分析天平：感量0.00001 g；KQ3200型超聲波清洗器；三乙胺，色譜純，F(xiàn)isher公司；甲醇，色譜純，默克公司；水由實(shí)驗(yàn)室MILLIPORE超純水儀自制。

1.2 試藥 氟苯尼考對(duì)照品(批號(hào) K0301305)，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；糠酸莫米松對(duì)照品(批號(hào) 510022-201301)、鹽酸特比萘芬對(duì)照品(批號(hào) 100503-201402)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。糠酸莫米松原料藥(批號(hào) 20140510)，鹽酸特比萘芬原料藥(批號(hào) 140301TH)，均購(gòu)自武漢那拉白醫(yī)藥化工有限公司。獸用制劑為實(shí)驗(yàn)室自制，制備過程為：將氟苯尼考、糠酸莫米松、鹽酸特比萘芬溶解于適宜輔料后，加純水至37.5 mL，即得。制劑中氟苯尼考、糠酸莫米松、鹽酸特比萘芬的濃度分別為15 mg/mL、2 mg/mL、15 mg/mL。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Thermo C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇-0.02%三乙胺水溶液(75 ∶25)為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，流速為1.0 mL/min，以224 nm作為氟苯尼考及鹽酸特比萘芬的檢測(cè)波長(zhǎng)、以250nm作為糠酸莫米松的檢測(cè)波長(zhǎng)，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣10 μL檢測(cè)。在上述色譜條件下，氟苯尼考、糠酸莫米松、鹽酸特比萘芬峰的理論塔板數(shù)均大于5000，分離度均大于1.5。

2.2 混合對(duì)照品溶液的配制 精密稱取對(duì)照品氟苯尼考9.91 mg，糠酸莫米松19.95 mg、鹽酸特比萘芬10.02 mg，分別置10 mL、25 mL、10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取氟苯尼考溶液5.0 mL、糠酸莫米松溶液2.0 mL、鹽酸特比萘芬溶液5.0 mL分別置于100 mL、200 mL、100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得各對(duì)照品稀釋液。從三種對(duì)照品稀釋液中精密吸取適量于10 mL容量瓶中，配制成不同濃度的混合對(duì)照品溶液，用于含量測(cè)定。

2.3 供試品溶液的配制 精密吸取自制制劑2.0 mL，置200 mL容量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻。再精密吸取5.0 mL置50 mL容量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 陰性供試品溶液的配制 取各輔料，除不添加氟苯尼考、糠酸莫米松、鹽酸特比萘芬原料藥外，其他操作同自制制劑。配制完成后搖勻，精密吸取2.0 mL置200 mL容量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻。再精密吸取5.0 mL置50 mL容量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5 專屬性試驗(yàn) 分別吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液各10 μL，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，氟苯尼考、糠酸莫米松、鹽酸特比萘芬與相應(yīng)的對(duì)照品的色譜峰保留時(shí)間一致，達(dá)到基線分離，此時(shí)混合對(duì)照品溶液中，三種成分的濃度分別為14.76 μg/mL、3.18 μg/mL、15.00 μg/mL。陰性樣品色譜中與氟苯尼考、糠酸莫米松、鹽酸特比萘芬峰相應(yīng)的保留時(shí)間處無吸收峰，表明制劑中其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。見圖1。

1.氟苯尼考；2.糠酸莫米松；3.鹽酸特比萘芬A.混合對(duì)照品溶液(224 nm檢測(cè))；B.混合對(duì)照品溶液(250 nm檢測(cè))；C.陰性樣品溶液(224 nm檢測(cè))；D.陰性樣品溶液(250 nm檢測(cè))；E.供試品溶液(224 nm檢測(cè))；F.供試品溶液(250 nm檢測(cè))1.Florfenicol；2.Mometasone furoate；3.Terbinafine hydrochloride1.Mixed reference solution(224 nm);B.Mixed reference solution(250 nm)；C.Negative sample solution(224 nm);D.Negative sample solution(250 nm);E.Test solution(224 nm);F.Test solution(250 nm)圖1 高效液相色譜圖Fig 1 The High performance liquid chromatogram

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得氟苯尼考、糠酸莫米松、鹽酸特比萘芬回歸方程(n=8)：Y=22754244.64X+1239.20，r=1.000；Y=28139914.58X-1198.81，r=1.000；Y=149172957.70X-17145.80，r=1.000。結(jié)果表明，氟苯尼考質(zhì)量濃度在0.49～49.20 μg/mL，糠酸莫米松在0.24～7.96 μg/mL、鹽酸特比萘芬在0.25～50.00 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與溶液濃度線性關(guān)系良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取自制制劑樣品，照“2.3”項(xiàng)下方法配制6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果氟苯尼考、糠酸莫米松、鹽酸特比萘芬平均含量分別為15.46 mg/mL、2.07 mg/mL、15.35 mg/mL，RSD分別為0.64%、0.75%、0.63%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并計(jì)算RSD值。氟苯尼考、糠酸莫米松、鹽酸特比萘的RSD分別為0.75%、0.63%、0.68%，表明方法精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下的供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定氟苯尼考、糠酸莫米松、鹽酸特比萘芬的峰面積，其RSD分別為0.36%、0.70%和0.40%，表明供試品溶液穩(wěn)定。

2.10 定量限與檢出限 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液進(jìn)行逐步稀釋，取稀釋后溶液進(jìn)樣檢測(cè)。按照10倍噪音計(jì)算最低定量限濃度，氟苯尼考、糠酸莫米松和鹽酸特比萘芬的最低定量限濃度分別為：0.49 μg/mL、0.24 μg/mL、0.20 μg/mL；按照3倍噪音計(jì)算最低檢出限濃度，氟苯尼考、糠酸莫米松和鹽酸特比萘芬的最低檢出限濃度分別為：0.25 μg/mL、0.16 μg/mL、0.13 μg/mL。

2.11 回收率試驗(yàn) 自制制劑中氟苯尼考原料藥的量為562.5 mg、糠酸莫米松原料藥的量為75 mg、鹽酸特比萘芬原料藥的量為562.5 mg。分別按照三個(gè)添加量添加原料藥，氟苯尼考添加量為450、562.5、675 mg，糠酸莫米松添加量為60、75、90 mg，鹽酸特比萘芬添加量為450、562.5、675 mg，每個(gè)添加量平行三份，照“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率(表1)。其中，氟苯尼考的回收率在99.06%～103.68%之間，平均回收率為100.80%，RSD值為1.89%；糠酸莫米松的回收率在101.53%～104.94%之間，平均回收率為102.83%，RSD值為1.17%；鹽酸特比萘芬的回收率在99.84%～103.54%之間，平均回收率為101.37%，RSD值為1.59%。上述試驗(yàn)結(jié)果表明該方法回收率高。

3 討論與小結(jié)

3.1 流動(dòng)相的確定 本試驗(yàn)曾參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010年版)一部中收錄的氟苯尼考含量測(cè)定方法[2]、國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)糠酸莫米松(征求意見稿)中收錄的糠酸莫米松含量測(cè)定方法[3]及《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)二部中收錄的鹽酸特比萘芬含量測(cè)定方法[4]同時(shí)測(cè)定獸用制劑中氟苯尼考、糠酸莫米松、鹽酸特比萘芬的含量，以便測(cè)定方法的推廣和應(yīng)用。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，三種方法均無法同時(shí)測(cè)定三種成分的含量。氟苯尼考含量測(cè)定方法的流動(dòng)相為乙腈-水-冰醋酸(100∶197∶3)，以流動(dòng)相為溶劑溶解樣品?？匪崮姿稍谠撊軇┲腥芙舛葮O低，進(jìn)樣后無響應(yīng)；鹽酸特比萘芬峰的保留時(shí)間長(zhǎng)于45 min，且峰形不佳。鹽酸特比萘芬含量測(cè)定方法為：以三乙胺緩沖液(0.2%三乙胺溶液，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至7.5)-甲醇-乙腈(30∶42∶28)為流動(dòng)相A，以三乙胺緩沖液-甲醇-乙腈(5∶57∶38)為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，梯度時(shí)間為38 min，以乙腈-水(1∶1)為溶劑溶解樣品。流動(dòng)相配制過程復(fù)雜，色譜圖中氟苯尼考峰形不佳，糠酸莫米松無響應(yīng)，鹽酸特比萘芬出峰正常，但保留時(shí)間較長(zhǎng)。糠酸莫米松含量測(cè)定方法的流動(dòng)相是甲醇-水(65∶35)，以流動(dòng)相為溶劑溶解樣品。在該液相條件下，氟苯尼考峰會(huì)受到輔料的干擾，無法準(zhǔn)確測(cè)定；鹽酸特比萘芬峰保留時(shí)間長(zhǎng)，且拖尾嚴(yán)重。為改善氟苯尼考與干擾峰的分離度，優(yōu)化流動(dòng)相比例為甲醇-水(75∶25)。為改善鹽酸特比萘芬峰形，在水相中加入少量三乙胺。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同濃度的三乙胺水溶液(0.004%、0.008%、0.02%、0.04%)對(duì)三種成分保留時(shí)間、分離度、拖尾因子、理論塔板數(shù)影響不大?？紤]到三乙胺為易揮發(fā)性液體，為避免流動(dòng)相配制過程中由于三乙胺揮發(fā)而造成試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，最終選擇0.02%三乙胺水溶液為本試驗(yàn)的水相。故本試驗(yàn)采用“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Sample recovery rate test results

3.2 色譜柱的確定 考察Thermo Hypersil GOLD C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Eclipse XDB-C8(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Waters Symmetry?C8 (4.6 mm×75 mm，5 μm)等色譜柱對(duì)三種成分保留時(shí)間、分離度、拖尾因子、理論塔板數(shù)的影響。結(jié)果表明，在相同試驗(yàn)條件下，Agilent C18色譜柱對(duì)鹽酸特比萘芬的保留時(shí)間為74.87 min，理論塔板數(shù)約為665，保留時(shí)間過長(zhǎng)，理論塔板數(shù)過低；Agilent C8色譜柱對(duì)氟苯尼考的保留時(shí)間為1.65 min，理論塔板數(shù)為958，保留時(shí)間較短，理論塔板數(shù)較低；Waters C8色譜柱對(duì)氟苯尼考的保留時(shí)間為0.94 min，保留時(shí)間過短。綜合試驗(yàn)結(jié)果，Thermo Hypersil GOLD C8色譜柱對(duì)三種成分的保留時(shí)間分別為3.29 min、4.97 min、15.17 min，分離度分別為3.8、2.9、2.1，拖尾因子分別為1.2、1.1、1.1，理論塔板數(shù)分別為6384、9306、15002，故選擇Thermo Hypersil GOLD C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)為試驗(yàn)用色譜柱。

3.3 色譜柱溫度的確定 在含量測(cè)定過程中發(fā)現(xiàn)，糠酸莫米松的保留時(shí)間會(huì)隨室溫的變化而變化。為確保試驗(yàn)的重復(fù)性，應(yīng)固定色譜柱溫度。調(diào)節(jié)色譜柱溫度為25、30、35 ℃，考察柱溫對(duì)三種成分保留時(shí)間、分離度、拖尾因子、理論塔板數(shù)的影響。結(jié)果表明，三種試驗(yàn)溫度下，這三種成分的色譜行為均良好。結(jié)合試驗(yàn)室室溫變化，最終確定試驗(yàn)柱溫為30 ℃。

本文建立的高效液相色譜法靈敏、簡(jiǎn)單易行，專屬性、重復(fù)性、回收率均符合要求，能夠同時(shí)測(cè)定獸用制劑中氟苯尼考、糠酸莫米松及鹽酸特比萘芬的含量。