miR-198通過(guò)調(diào)控盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體2影響肺癌細(xì)胞放療抵抗的分子機(jī)制

田映國(guó)，金勇，陳麗，陳洪明，粟芙蓉，何裕，許琴，蔣成英，田雨，萬(wàn)小亞

miR-198通過(guò)調(diào)控盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體2影響肺癌細(xì)胞放療抵抗的分子機(jī)制

田映國(guó)，金勇，陳麗，陳洪明，粟芙蓉，何裕，許琴，蔣成英，田雨，萬(wàn)小亞

638001 四川，廣安市岳池縣人民醫(yī)院腫瘤科（田映國(guó)、金勇、陳洪明、粟芙蓉、何裕、許琴、蔣成英、田雨、萬(wàn)小亞）；638400 四川，廣安市武勝縣人民醫(yī)院腫瘤科（陳麗）

旨在探討 miR-198 通過(guò)調(diào)控盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體2（DDR2）影響肺癌細(xì)胞放療抵抗的分子機(jī)制。

培養(yǎng)人正常胚肺細(xì)胞與肺癌細(xì)胞，通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)比較各種細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè) DDR2 與 miR-198 的關(guān)系。RT-PCR 和 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平。Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。

人肺癌細(xì)胞株 A549 對(duì)放療最不敏感，放療抵抗細(xì)胞株 A549-R 中miR-198 表達(dá)顯著低于其他細(xì)胞且 DDR2 表達(dá)顯著高于其他細(xì)胞。DDR2 是 miR-198 的直接靶基因，過(guò)表達(dá) miR-198 顯著抑制 A549-R 細(xì)胞中 DDR2 蛋白的表達(dá)水平，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，同時(shí)顯著抑制了細(xì)胞的遷移能力。

miR-198 通過(guò)直接靶向 DDR2 調(diào)控肺癌細(xì)胞對(duì)放療的抵抗作用。

miR-198； 盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體 2； 肺癌細(xì)胞； 放療抵抗

肺癌是目前最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的首位[1]，且預(yù)后不良[2]，目前對(duì)于肺癌的治療方法主要有手術(shù)、化療和放療等。放療在控制持續(xù)性或復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)、控制激素分泌中發(fā)揮著重要的作用[3]。接受放療的患者局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較低[4]，能顯著延長(zhǎng)患者生存期，降低死亡率[5]。因此放療在臨床情況下對(duì)惡性腫瘤的控制與姑息治療具有重要的作用[6]。但是放療抵抗是影響患者生存率的關(guān)鍵因素[7]，因此尋找調(diào)控放療抵抗的分子機(jī)制迫在眉睫。

microRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度在 18 ~ 22 個(gè)核苷酸的非編碼小分子 RNA，與靶標(biāo) mRNA 非編碼區(qū)的 3'端結(jié)合[8]，阻止 mRNA 的翻譯從而調(diào)控靶基因的表達(dá)來(lái)影響相應(yīng)細(xì)胞的生物學(xué)行為[9]，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 參與許多癌癥和腫瘤進(jìn)展，具有抑癌和致癌基因的功能[10]。但 miR-198 通過(guò)靶向盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體 2（DDR2）影響肺癌細(xì)胞放療抵抗的分子機(jī)制的研究未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究通過(guò)檢測(cè)miR-198 和 DDR2 在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其與細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系，探討 miR-198 通過(guò)調(diào)控 DDR2 影響肺癌細(xì)胞放療抵抗的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌細(xì)胞 A549、人肺癌細(xì)胞（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）NCI-H292、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H446 和人胚肺細(xì)胞 WI-38 均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所；DMEM 培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素、胎牛血清和胰蛋白酶等均購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；RT-PCR 試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑等購(gòu)自美國(guó) Thermor Fisher 公司；引物由日本 Takara 公司合成；抗體購(gòu)自美國(guó) Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人肺癌細(xì)胞 A549、人肺癌細(xì)胞（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）NCI-H292、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H446 和人胚肺細(xì)胞 WI-38采用 DMEM 培養(yǎng)基（含 1% 青霉素和鏈霉素、10% 胎牛血清），放置在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

用無(wú)血清的 DMEM 培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，輕吹混勻，標(biāo)記為 A 液；用無(wú)血清的 DMEM 培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染試劑，輕吹混勻，標(biāo)記為 B 液；將 A 液輕輕加入B 液，輕吹混勻，室溫放置 15 min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；在轉(zhuǎn)染復(fù)合物中慢慢滴加待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，輕晃混勻，放置在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 ~ 48 h 后，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 RT-PCR 檢測(cè)法 提取細(xì)胞總 RNA，調(diào)整統(tǒng)一濃度后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，擴(kuò)增引物見(jiàn)表 1，反應(yīng)條件為 94 ℃ 5 s，62 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果用 F = 2-△△ct計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

表 1 引物序列

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的單層細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后吹打成單個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮液在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細(xì)胞懸浮液做梯度密度稀釋后接種于培養(yǎng)皿上，即 50、100、200 個(gè)細(xì)胞/皿，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 ~ 3 周。當(dāng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS 小心浸洗 3 次，干燥后，加純甲醛固定 15 min，再用 PBS 清洗3 次，加入結(jié)晶紫染色 10 ~ 30 min。用 PBS 緩慢洗去染色液，空氣干燥后用肉眼直接計(jì)算克隆數(shù)（> 50 個(gè)細(xì)胞的為一個(gè)克?。?。平板克隆形成率（%）= 形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù) × 100%。

1.2.4 放射抵抗細(xì)胞株的建立 體外培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株 A549，待細(xì)胞生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，給予直線加速器產(chǎn)生的 6 MV X 射線進(jìn)行垂直放射線照射，射線的劑量分別為 2、4、6、8、10、12 Gy，每種梯度照射 2 次。照射后繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，密切觀察細(xì)胞狀態(tài)。加入新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)良好后，再進(jìn)行下一次的照射，并根據(jù)濃度梯度逐漸加大放療的劑量，直到建立具有穩(wěn)定耐受放射線能力的人肺癌細(xì)胞株 A549，命名篩選出的細(xì)胞為 A549-R。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 生物信息預(yù)測(cè) miR-198 基因序列上 DDR2的結(jié)合片段，用 RT-PCR 對(duì)該片段進(jìn)行擴(kuò)增并插入到熒光素酶載體中，構(gòu)建 WT DDR2 3'UTR 野生質(zhì)粒。利用基因突變技術(shù)將 miR-198 和 DDR2 結(jié)合片段中的部分基因突變，構(gòu)建 Mut DDR2 3'UTR 突變質(zhì)粒。用 miR-198 mimic 和 DDR2 野生或突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 A549-R 細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)法 提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量后調(diào)整統(tǒng)一濃度。用 SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白片段后，轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂牛奶封閉 1 h，TBST 漂洗 3 次，加一抗稀釋液進(jìn)行孵育，4 ℃過(guò)夜；TBST 漂洗 3 次，加二抗稀釋液孵育，室溫 1 h；TBST 漂洗 3 次，用 ECL 發(fā)光液進(jìn)行成像分析。

1.2.7 Transwell 小室實(shí)驗(yàn) 將 Transwell 小室放入 24 孔板內(nèi)，上室接種轉(zhuǎn)染miR-198 mimics 或 miR-198 NC 后的 A549-R 細(xì)胞懸液 200 μl，下室加 600 μl 含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng) 12 h 后，棉簽擦去微孔膜上室的細(xì)胞，PBS 小心沖洗小室，4% 多聚甲醛固定遷移并黏附到小室微孔膜下面的細(xì)胞 20 min，1% 結(jié)晶紫染色 20 min，PBS 沖洗小室，將下室置于顯微鏡下隨機(jī)選擇 5 個(gè)不同視野記錄穿透膜的細(xì)胞數(shù)，求平均值，重復(fù) 3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肺癌細(xì)胞 A549放射抵抗細(xì)胞株的建立

人肺癌細(xì)胞（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）NCI-H292、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H446 和人肺癌細(xì)胞 A549 經(jīng)不同劑量放射處理后，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果（圖 1）顯示，相比于 A549 細(xì)胞，NCI-H292 和NCI-H446 細(xì)胞對(duì)放療更為敏感。

圖 1 平板克隆實(shí)驗(yàn)分析

Figure 1 Plate cloning experiment analysis

2.2 miR-198 在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)

如圖 2 所示，與人正常胚肺細(xì)胞 WI-38 相比，人肺癌細(xì)胞 A549、人肺癌細(xì)胞（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）NCI-H292、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H446 和人肺癌細(xì)胞 A549 放射抵抗細(xì)胞 A549-R 的 miR-198 的表達(dá)量均顯著降低（< 0.05），且放射抵抗細(xì)胞 A549-R 中 miR-198 的表達(dá)量顯著低于人肺癌細(xì)胞 A549（< 0.05）。

2.3 DDR2 在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)

如圖 3 所示，與人正常胚肺細(xì)胞 WI-38 相比，人肺癌細(xì)胞 A549、人肺癌細(xì)胞（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）NCI-H292、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H446 和人肺癌細(xì)胞 A549放射抵抗細(xì)胞 A549-R 的 DDR2 的表達(dá)量均顯著升高（< 0.05），且放射抵抗細(xì)胞 A549-R 中 DDR2 的表達(dá)量顯著高于人肺癌細(xì)胞 A549（< 0.05）。

圖 2 miR-198 在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)（*P < 0.05，與正常胚肺細(xì)胞WI-38 相比；#P < 0.05，與人肺癌細(xì)胞 A549 相比）

Figure 2 Expression of miR-198 in lung cancer cells (*< 0.05, compared to WI-38;#< 0.05, compared to A549)

2.4 DDR2 是 miR-198 的靶基因

通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn) DDR2 可能是 miR-198 的潛在靶基因。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，本研究做了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果如圖4A所示，miR-198 可以結(jié)合 DDR2 3'UTR，并且 miR-198 可以負(fù)調(diào)控 DDR2 的表達(dá)。Western blot 檢測(cè)結(jié)果（圖 4B）顯示，過(guò)表達(dá) miR-198 顯著抑制 A549-R 細(xì)胞中 DDR2 蛋白的表達(dá)水平，抑制 miR-198 的表達(dá)顯著促進(jìn) A549-R 細(xì)胞中 DDR2 蛋白的表達(dá)。

圖 3 DDR2 在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)（*P < 0.05，與正常胚肺細(xì)胞WI-38 相比；#P < 0.05，與人肺癌細(xì)胞 A549 相比）

Figure 3 Expression of DDR2 in lung cancer cells (*< 0.05, compared to WI-38;#< 0.05, compared to A549)

圖 4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)DDR2 表達(dá)（A）和Western blot 檢測(cè)DDR2表達(dá)（B）（*P < 0.05，與miR-198 NC相比）

Figure 4 DDR2 expression was detected by double luciferase reporter gene assay (A) and Western blot (B) (*< 0.05, compared to miR-198 NC)

圖 5 肺癌細(xì)胞放療抵抗的分子機(jī)制（A：RT-PCR 檢測(cè)miR-198 表達(dá)；B：平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分析 A549-R 細(xì)胞對(duì)放療的敏感性；C：Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移數(shù)；*P < 0.05，與miR-198 NC 和miR-198 mimics 相比）

Figure 5 Molecular mechanisms of radiotherapy resistance in lung cancer cells (A: miR-198 expression was detected by RT-PCR; B: The sensitivity of A549-R cells to radiotherapy was analyzed by plate cloning experiment analysis; C: Cell migration was measured by Transwell assay;*< 0.05, compared to miR-198 NC and miR-198 mimics)

2.5 肺癌細(xì)胞放療抵抗的分子機(jī)制

RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果如圖 5A 所示，過(guò)表達(dá) miR-198 可顯著促進(jìn) A549-R 細(xì)胞中 miR-198 的表達(dá)（< 0.05）。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果如圖 5B 所示，在不同劑量的放射處理下，過(guò)表達(dá) miR-198 可增強(qiáng) A549-R 細(xì)胞對(duì)放療的敏感性；過(guò)表達(dá) DDR2 可增強(qiáng) A549-R 細(xì)胞對(duì)放療的抵抗作用；同時(shí)過(guò)表達(dá) miR-198 和 DDR2，A549-R 細(xì)胞對(duì)放療的敏感性介于單獨(dú)過(guò)表達(dá) miR-198 和 DDR2，即 miR-198 通過(guò)調(diào)控 DDR2 影響肺癌細(xì)胞的放療抵抗作用。

如圖 5C 所示，A549-R 細(xì)胞中過(guò)表達(dá) miR-198 后再給予 8 Gy 放射后顯著抑制了細(xì)胞的遷移能力（< 0.05），但過(guò)表達(dá) DDR2 后再給予 8 Gy 放射后顯著促進(jìn)了細(xì)胞的遷移能力（< 0.05）。

3 討論

肺癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)發(fā)病率和死亡率的主要原因，對(duì)人類生命安全造成巨大的威脅[11-12]，目前對(duì)于肺癌的治療主要為放化療，但是化療抵抗和腫瘤耐藥是治療肺癌的難點(diǎn)也是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素[13]。因此本研究通過(guò)建立具有穩(wěn)定耐受放射線能力的人肺癌細(xì)胞株 A549-R，探討影響肺癌細(xì)胞放療抵抗的分子機(jī)制。

DDRs是一種跨膜酪氨酸酶受體，有 DDR1 及 DDR2兩個(gè)家族成員，研究發(fā)現(xiàn) DDR2 是腫瘤血管新生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者[14]，DDR2 在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)來(lái)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移等惡性生物學(xué)行為[15]等。本研究發(fā)現(xiàn)，DDR2 在 A549-R 細(xì)胞中顯著上調(diào)表達(dá)，過(guò)表達(dá) DDR2 可增強(qiáng) A549-R 細(xì)胞對(duì)放療的抵抗作用，提示 DDR2 可能是肺癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因子，有望成為肺癌放療抵抗治療的潛在分子靶點(diǎn)。

有研究發(fā)現(xiàn)，miR-198 通過(guò)靶向目標(biāo)基因影響多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]，比如 miR-198 通過(guò)靶向含 CUB 結(jié)構(gòu)域蛋白 1（CDCP1）蛋白在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用[17]，miR-198 通過(guò)靶向甲基鳥(niǎo)嘌呤 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）增強(qiáng)替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的敏感性[18]，長(zhǎng)鏈非編碼 RNA SChLAP1 通過(guò)靶向 miR-198 和促進(jìn)絲裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1）通路加速前列腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[19]等。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在 A549 和 A549-R 細(xì)胞中 miR-198 顯著下調(diào)表達(dá)，過(guò)表達(dá) miR-198 可以顯著降低 A549-R 細(xì)胞中 DDR2 的表達(dá)，提示 miR-198 可能是肺癌放療抵抗抑制因子，同時(shí) DDR2 可能是 miR-198 的潛在靶基因。

我們進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站確定了 DDR2 可能是 miR-198 的潛在靶基因的假設(shè)，緊接著我們采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了這一假設(shè)的真實(shí)性。為了確定 miR-198 通過(guò)調(diào)控 DDR2 影響肺癌細(xì)胞放療抵抗的作用，本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá) miR-198 可增強(qiáng) A549-R 細(xì)胞對(duì)放療的敏感性且顯著抑制了細(xì)胞的遷移能力；過(guò)表達(dá) DDR2 可增強(qiáng) A549-R 細(xì)胞對(duì)放療的抵抗作用且顯著促進(jìn)了細(xì)胞的遷移能力，這些數(shù)據(jù)表明 miR-198 通過(guò)調(diào)控 DDR2 影響肺癌細(xì)胞的放療抵抗作用。miRNA 與靶標(biāo) mRNA 通常發(fā)生不完全結(jié)合，并且結(jié)合的位點(diǎn)是 mRNA 的非編碼區(qū)的 3'端，且它不會(huì)降解靶標(biāo) mRNA，只是阻止 mRNA 的翻譯，從而調(diào)節(jié)與生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的基因[20-22]。以上提示 miR-198 與靶基因 DDR2 mRNA 的 3'端非編碼區(qū)結(jié)合削弱了肺癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，通過(guò)過(guò)表達(dá) miR-198 可增強(qiáng) A549-R 細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。

綜上所述，miR-198 在肺癌細(xì)胞中異常低表達(dá)，DDR2 在肺癌細(xì)胞中異常高表達(dá)，miR-198 通過(guò)調(diào)控 DDR2 影響肺癌細(xì)胞放療抵抗作用。本研究揭示了肺癌細(xì)胞放療抵抗的部分分子機(jī)制，為肺癌放療治療提供了新的靶點(diǎn)。

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miR-198 affects the molecular mechanism of radiotherapy resistance in lung cancer cells by regulating DDR2

TIAN Ying-guo, JIN Yong, CHEN Li, CHEN Hong-ming, SU Fu-rong, HE Yu, XU Qin, JIANG Cheng-ying, TIAN Yu,WAN Xiao-ya

Author Affiliation: The People’s Hospital of Yuechi, Guang'an 638001, China (TIAN Ying-guo, JIN Yong, CHEN Hong-ming, SU Fu-rong, HE Yu, XU Qin, JIANG Cheng-ying, TIAN Yu, WAN Xiao-ya); The People’s Hospital of Wusheng, Guang'an 638400, China (CHEN Li)

To investigate the molecular mechanism of miR-198 regulating the radiotherapy resistance of lung cancer cells by regulating DDR2.

Human normal lung cancer cells and lung cancer cells were cultured, and the sensitivity of various cells to radiotherapy was examined by colony formation experiments. Dual luciferase reporter assay was used to detect the relationship between DDR2 and miR-198. The expression levels of related genes were detected by RT-PCR and Western blot. The transwell assay was applied to measure cell migration ability.

Human lung cancer cell line A549 was the least sensitive to radiotherapy among the tested cell lines. The expression of miR-198 in radiotherapy-resistant cell line A549-R was significantly lower than that in other cells and the expression of DDR2 was clearly higher than that in other cells. DDR2 is a direct target gene for miR-198. Overexpression of miR-198 significantly deceased the level of DDR2 protein in A549-R cells, enhanced the sensitivity of cells to radiotherapy, and significantly inhibited cell migration ability.

miR-198 regulates the resistance of lung cancer cells to radiotherapy by directly targeting DDR2.

miR-198; Discoidin domain receptor 2; Lung cancer cells; Radiotherapy resistance

TIAN Ying-guo, Email: tyg2803541548@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.007

田映國(guó)，Email：tyg2803541548@163.com

2019-04-19