潘霞 胡盈盈 陳澤宇
摘 要:以浙江省磐安浙貝母(Fritillaria thunbergii Miq.)為研究對象,利用PCR-DGGE技術(shù),研究連作對浙貝母根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明,連作條件下浙貝母根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,主要表現(xiàn)為細菌種群數(shù)量顯著減少;但連作年限對浙貝母根際土壤細菌多樣性的影響較小,細菌群落結(jié)構(gòu)變化不明顯。對浙貝母根際土壤細菌種群的DGGE電泳結(jié)果進行主成分分析,分析結(jié)果顯示,所取浙貝母土壤樣品的細菌優(yōu)勢種群為蠟樣芽胞桿菌群(Bacillus cereus.Frankland)、芽胞桿菌屬(Bacillus Cohn)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)。綜上表明,浙貝母連作后根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和功能的改變可能是導(dǎo)致浙貝母連作障礙產(chǎn)生的重要原因之一。
關(guān)鍵詞:浙貝母;連作;根際土壤;細菌群落
一、材料與方法
1.實驗材料.浙貝母根際土壤樣品采自浙江省磐安塘下村種植大田。土壤以紅壤為主,浙貝母種植基本為連作種植,除連作年限外土壤處理背景一致。取浙貝母未連作土壤、連作2年土壤、連作多年根際土壤樣品。
2.研究方法
(1)取樣方法,去除2~3 cm的表層土,完整挖出浙貝母的全部根系,將大塊土抖落,取附著在根系上的細土至干凈的取樣袋中,不同連作年限的浙貝母根際土壤各取三份作為實驗組,取未連作土壤三份作為對照。采樣后密封保存在4℃冰箱中。
(2)土壤DNA的提取純化,釆用OMEGA的E.Z.N.A.Soil DNA Kit試劑盒提取浙貝母根際土壤的微生物總DNA。
(3)16S rDNA V3 片段 PCR 擴增。擴增目的DNA為細菌16S部分核糖體核苷酸序列。PCR程序模式為touchdown-PCR程序。反應(yīng)總體系為ddH2O 17 μL,10×buffer 2.5 μL,dNTP 2 μL,Primer 534 1 μL,Primer 341-GC 1 μL,Ex Tag酶0.5 μL和DNA模板1 μL。擴增后的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。
(4)變性梯度凝膠電泳,配置高低兩種濃度的凝膠溶液,加入40 μL 10%過硫酸銨與10 μL TEMED,并迅速渦旋注入連通柱。打開連通閥并運轉(zhuǎn)蠕動泵,轉(zhuǎn)速為15 rpm。待凝膠溶液注入玻板指定高度后,將泵管置于廢液缸,立即往灌膠器中注滿MQ,開始清洗。
在電泳槽中注入1×TAE緩沖液。放入加熱罩后設(shè)置緩沖液加熱溫度為65℃。待膠凝固,往玻璃板中插入樣梳,并使之傾斜,用移液槍灌注上層膠,加入4 mL后,將樣梳擺正。待膠凝固,拔出樣梳,用1×TAE清洗。每個點樣孔上樣液為PCR產(chǎn)物15 μL、3×loading buffer 7.5 μL。將電泳液溫度設(shè)置為60℃,電泳為50 V,13 h。當電泳結(jié)束,切去上層膠,并在上樣端切角標記。本實驗采用銀染法進行染膠。染色結(jié)束后用Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)對觀察到的結(jié)果進行拍照,最后用Bio-Rad Quantity One軟件對DGGE條帶進行分析。
(5)割膠回收與克隆測序。挑選DGGE電泳膠上的優(yōu)勢條帶并進行割膠回收,之后進行純化。純化產(chǎn)物用pMD-18-T載體進行克隆。選取較亮的PCR條帶所代表的菌液作為測序菌液進行分裝,送至上海生工公司進行測序。
二、結(jié)果與分析
PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)DGGE檢測后獲得多條清晰條帶。條帶隨著連作年限增加亮度降低,連作多年的浙貝母土壤樣品較連作兩年的DGGE條帶亮度變化較小,個別條帶在亮度上有差別。從條帶數(shù)量上看,隨著連作年限增加,DGGE條帶數(shù)目逐漸減少。同樣,連作多年的土壤樣品較連作兩年的土壤樣品DGGE條帶數(shù)量變化不明顯。DGGE電泳條帶數(shù)可以近似認為是細菌種群的數(shù)量,而條帶的亮度則反映了該種細菌數(shù)量的多少[8]。據(jù)此初步推斷,連作導(dǎo)致浙貝母根際土壤細菌種群的數(shù)量減少,影響了根際土壤中細菌群落的組成。
通過測序結(jié)果可知,浙貝母連作兩年與連作多年土壤樣品中細菌種群數(shù)較未連作土壤樣品中細菌種群數(shù)顯著減少。但連作多年土壤樣品中細菌種群數(shù)量和連作兩年土壤樣品中細菌種群數(shù)量無明顯差別。隨著連作年限的增加,個別種群的細菌數(shù)量也逐漸減少,可以從同一層次的條帶亮度逐漸降低看出。連作兩年的土壤樣品中,條帶1B、2B、3B和9B特別亮,經(jīng)序列分析,推斷其為蠟樣芽胞桿菌群、芽胞桿菌屬及鞘氨醇單胞菌屬,相似菌株最大相似度分別為99%、99%和100%。連作多年的土壤樣品中,上述菌數(shù)量減少,其條帶亮度降低。據(jù)此推斷,在連作條件下,浙貝母根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,土壤微生態(tài)環(huán)境改變,影響了浙貝母的生長。而土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和功能的改變,與連作障礙有著密不可分的關(guān)系。
3 討論
在連作情況下,浙貝母根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)低于未連作狀態(tài),隨著連作年限增長,細菌種群數(shù)量減少并不明顯。對根際土壤細菌群落的DGGE結(jié)果進行主成分分析,結(jié)果表明,連作后土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成有明顯變化,土壤中優(yōu)勢種群為蠟樣芽胞桿菌群、芽胞桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬。研究發(fā)現(xiàn),作物連作后對土壤根際微生物的生長繁殖具有選擇性,能夠促進或抑制某些微生物生長,進而改變微生物種群的多樣性。根際土壤微生物功能的差異會影響植物所需營養(yǎng)物質(zhì)的提供[9],而植物對土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的選擇,可能是導(dǎo)致連作障礙產(chǎn)生的原因。
由以上討論可知,連作后浙貝母根際土壤細菌群落組成及功能的改變,使得浙貝母根際土壤微生態(tài)環(huán)境發(fā)生了變化,這與浙貝母連作障礙相關(guān)。但連作后浙貝母根際微生物群落除了上述菌落外,其結(jié)構(gòu)組成中還有哪些菌群發(fā)生了比較大的改變,以及它們與浙貝母連作障礙的機理關(guān)系還有待進一步研究。
參考文獻
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[3]趙鸝.麗水市浙貝母產(chǎn)業(yè)化發(fā)展策略與規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)研究[D].浙江杭州:浙江大學(xué),2004.
(作者單位:浙江師范大學(xué),化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院)