李松磊　李倩如

【摘 要】目的：探究輔助性T（Thelper，Th）細胞22細胞在不明原因復發(fā)性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）中的作用及其與Th17細胞之間的關系。方法：選擇2016年10月至2018年5月在鄭州大學第三附屬醫(yī)院婦產科門診就診的30例不明原因復發(fā)性流產患者為URSA組，選擇同期在本院行人流術的30例正常早孕婦女為對照組。采用流式細胞儀檢測兩組孕婦外周血中Th22細胞和Th17細胞的數量，采用酶聯免疫吸附試驗檢測兩組孕婦血漿中白細胞介素（interleukin，IL）-22和IL-17A的濃度的變化。結果：與對照組相比較，URSA組患者外周血中Th22細胞的數量和Th17細胞的數量顯著增多，血漿中IL-22和IL-17A的濃度同樣顯著升高;在URSA組中，Th22細胞數量與Th17細胞數量呈正相關，而在對照組中，未見明顯相關性;在URSA組中，IL-22的濃度不僅與Th22細胞的數量呈正相關，也與Th17細胞的數量呈正相關，但與Th22細胞的關聯強度較高。結論：Th22細胞的數量及其效應因子IL-22濃度的顯著增高可能與URSA具有一定相關性，同時在URSA中，Th22細胞與Th17細胞呈相關，提示兩種細胞的分化成熟，可能相互影響。

【關鍵詞】T淋巴細胞;不明原因復發(fā)性流產;白細胞介素

Study on the roles of Th22 cells and cytokines in unexplained recurrent spontaneous abortion

Li Songlei1，2， Li Qianru*1

1.School of Basic Medical Sciences， Zhengzhou University， Zhengzhou， Henan 450000;

2.Department of Clinical Laboratory， the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou， Henan 450000

[Abstract] Objective：To investigate the role of Th22 cells in unexplained recurrent spontaneous abortion and its relationship with Th17 cells. Methods： Thirty women with unexplained recurrent spontaneous abortion in the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University from October 2016 to May 2018 were enrolled as URSA group. Thirty healthy pregnant women were selected as control group. Flow cytometry was used to detect the frequencies of Th22 cells and Th17 cells in the peripheral blood of the two groups. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the changes of IL-22 and IL-17A in the plasma of the two groups. Results： The percentages of Th22 and Th17 cells in peripheral blood of URSA patients were significantly increased than those in the control group， and the plasma concentrations of IL-22 and IL-17A of URSA patients were also significantly increased than those in the control group. There was a positive correlation between the Th22 and Th17 cells in the URSA group， but not in the control group. In the URSA group Positive correlation was found in the plasma concentration of IL-22 with Th22 cells， and also with Th17 cells. But the intensity of correlation with Th22 cells is relatively high. Conclusions： Increased frequencies of Th22 cells and high levels of IL-22 may be associated with USRA. And Th22 cells are correlated with Th17 cells， suggesting that the differentiation and maturation of the two cells may interact with each other.

[Key words]T-lymphocytes; Unexplained recurrent spontaneous abortion; Interleukins

自然流產是一種常見的妊娠期并發(fā)癥，影響著約50%～60%的正常妊娠，據估計，有1%～3%的女性在妊娠20周以前經歷過3次或者3次以上的流產，這就被稱為復發(fā)性流產[1]。目前研究認為，復發(fā)性流產與染色體的異常、激素的異常分泌、子宮的畸形、感染、自身免疫性疾病等多種因素相關[2]。但是，以上機制僅能解釋少于50%的復發(fā)性流產，有大約60%復發(fā)性流產的發(fā)生不能用上述機制進行解釋，稱為不明原因復發(fā)性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[3]。有資料顯示，在很大程度上，不明原因復發(fā)性流產與免疫系統的異常調控密切相關[4]。其中，CD4+T淋巴細胞各亞群介導的免疫反應在不明原因復發(fā)性流產病因學中的作用是研究熱點之一[5]。

CD4+T淋巴細胞根據其轉錄因子和分泌的細胞因子的不同被分為Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、Th22細胞、Th9細胞和Treg細胞[6]。已有研究證實，Th1細胞與Th2細胞之間的免疫失衡，Th17細胞和Treg細胞之間的免疫失衡與不明原因復發(fā)性流產密切相關[7-8]。Th22細胞是新近報道的CD4+T淋巴細胞亞群，主要分泌細胞因子IL-22，不分泌細胞因子IFN-γ和IL-17，是一種在功能上和基因表達上獨立的細胞亞群，在皮膚穩(wěn)態(tài)的維持、自身免疫性疾病、炎癥性疾病和癌癥等多種疾病的發(fā)病中的發(fā)揮關鍵作用[9-11]。然而，關于Th22細胞及其效應細胞因子IL-22在生殖系統的研究甚少，故本研究通過檢測不明原因復發(fā)性流產患者外周血中Th22細胞及Th17細胞的數量變化，以及血漿中細胞因子IL-22和IL-17A濃度的變化，初步探討Th22細胞在不明原因復發(fā)性流產中的作用及其與Th17細胞之間的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2016年10月至2018年5月在鄭州大學第三附屬醫(yī)院婦產科門診就診的30例早期自然流產患者為URSA組，平均年齡為（29.00±2.45）歲，平均孕周為（8.69±1.22）周，以往均無活產史，B超未見胚胎心管搏動，孕期未使用黃體酮等藥物治療。選擇同期在本院行人流術的正常早孕婦女30例為對照組，平均年齡為（26.16±3.14）歲，平均孕周為（9.12±1.09）周。URSA組患者納入標準：1）有連續(xù)3次或3次以上的自然流產史;2）年齡小于40歲;3）夫婦雙方無染色體異常;4）性激素檢查，甲狀腺功能檢查，血糖，胰島素檢測及凝血功能檢測均正常;5）白帶常規(guī)、B超或子宮輸卵管造影等檢查排除生殖器官器質性病變，解剖畸形以及感染因素;6）宮頸分泌物培養(yǎng)排除支原體，衣原體等感染;7）TORCH IgM檢查均為陰性;8）抗心磷脂抗體、抗子宮內膜抗體、抗精子抗體、抗核抗體（ANA）、抗甲狀腺抗體（TPO-Ab、TG-Ab）等自身抗體均為陰性;9）男方精液分析正常;10）既往未接受過主動免疫治療。對照組納入標準：以往無自然流產史、死胎、死產史，排除染色體及生殖器官解剖異常、內分泌紊亂、自身免疫性疾病等疾病。有正常足月分娩一次以上。本次妊娠期間無腹痛及陰道出血，B超提示胚胎發(fā)育正常。研究經本院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。兩組孕婦的年齡和孕周相比較，差異均無統計學意義（P>0.05），可比較。

1.2 研究方法

1.2.1 標本的采集 兩組孕婦于入組時空腹狀態(tài)下采集靜脈血4mL，置于肝素鈉抗凝管中，其中2mL全血用于流式細胞檢測，2mL分離血漿于-80℃保存用于細胞因子檢測。

1.2.2 流式細胞術測定外周血中Th22細胞和Th17細胞的比例 取250μL肝素鈉抗凝全血，與250μL RPMI1640培養(yǎng)基（不含小牛血清）充分混勻后，加入1μL淋巴細胞刺激劑，于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)6h。培養(yǎng)后，取100μL細胞懸液，加入FITC標記的抗人CD3和PerCP-Cy5.5標記的抗人CD8a各5μL，室溫避光孵育30min，之后加入1mL溶血素，混勻后室溫避光10min，用PBS洗滌后加入1mL固定破膜劑，室溫避光孵育45min，加入破膜緩沖液洗滌2遍后，加入PE標記的IL-22和APC標記的IL-17A各5μl，室溫避光孵育30min，再加入破膜緩沖液洗滌2遍后，加入500μL染色緩沖液，采用FACS Calibur流式細胞儀進行檢測，流式細胞儀檢測結果用Flow Jo軟件進行分析，結果以Th22細胞和Th17細胞占CD4+T細胞的百分比表示。具體步驟如下：在淋巴細胞群中，以CD4設門，由于淋巴細胞刺激劑中佛波酯的作用會使淋巴細胞表面標志CD4發(fā)生內吞效應，因此本研究利用CD3和CD8a反設門CD4，之后再以IL-22和IL-17A的同型對照進行設門，將Th22細胞表示為CD3+CD8a-IL-17A-IL-22+細胞，將Th17細胞表示為CD3+CD8a-IL-17A+細胞。流式抗體、淋巴細胞刺激劑和固定破膜劑均購自美國eBioscoence公司。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗測定血漿中細胞因子IL-22和IL-17A的濃度 嚴格按照說明書步驟進行操作，以吸光度（A）為橫坐標，以濃度遞增的標準品為縱坐標，繪制標準曲線，計算濃度。

1.3 統計學分析

應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。正態(tài)分布的計量資料采用（±s）表示，組間采用獨立樣本t檢驗進行統計學分析，相關性檢驗采用Pearson相關性分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 URSA組與對照組孕婦外周血中Th22細胞、Th17細胞以及CD4+IL17A+IL-22+雙陽性T細胞數量的比較

URSA組孕婦外周血中Th22細胞、Th17細胞和CD4+IL17A+IL-22+雙陽性細胞的數量顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1，圖1。

圖1 兩組孕婦外周血中Th22細胞、Th17細胞及CD4+IL17A+IL-22+雙陽性T細胞占CD4+T淋巴細胞百分比的流式分析圖

2.2 URSA組與對照組孕婦血漿中細胞因子IL-22和IL-17A濃度的比較

URSA組孕婦血漿中細胞因子IL-22和IL-17A的濃度顯著高于對照組，差異均具有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 URSA組和對照組孕婦外周血中Th22細胞和Th17細胞的相關性分析

在URSA組中，Th22細胞的數量與Th17細胞的數量呈正相關（r=0.690，P=0.000），而在對照組中，Th22細胞的數量和Th17細胞的數量無相關性（r=0.269，P=0.204）。

2.4 URSA組中細胞因子IL-22與Th22細胞、Th17細胞的關系

在URSA組中，血漿中IL-22的濃度與Th22細胞的數量呈正相關（r=0.590，P=0.002），同時與Th17細胞的數量也呈正相關（r=0.401，P=0.047）。

3 討論

從免疫學的觀點來看，在人類妊娠中，胎兒攜帶有父源性基因和抗原，這對母體免疫系統來說是一種半同種異體移植物，因此，正常妊娠的維持必定需要一種保護機制來避免母體免疫系統對胎兒發(fā)生排斥反應[12]。一旦這種免疫耐受的保護機制被打破，就會引發(fā)病理性妊娠，復發(fā)性流產就是一種常見的病理性妊娠。在復發(fā)性流產中，URSA占半數以上，然而，該種疾病的發(fā)病原因不可得知，因此在該病的治療和預防上存在較大的難度[13]。有資料顯示，免疫系統的調控異常與URSA的發(fā)生密切相關，CD4+T淋巴細胞之間的異常作用和細胞因子的分泌紊亂是一個關鍵因素[5]。研究表明，Th1細胞和Th2細胞之間的免疫失衡與Th17細胞和Treg細胞之間的免疫失衡在URSA中發(fā)揮關鍵作用[14]。本研究重點關注于新近發(fā)現的CD4+T淋巴細胞亞群Th22細胞，初步探討Th22細胞與URSA的關系，以及在URSA中其與Th17細胞的關系。

Th22細胞是Eyerich S等研究者在2009年首次報道的一種新穎的Th細胞亞群，該細胞主要分泌IL-22，但不分泌IFN-γ，IL-4和IL-17，是一種有別于Th1細胞、Th2細胞和Th17細胞的細胞群體[9]。IL-22是Th22細胞的主要效應分子，IL-22通過與其廣泛分布于細胞、組織和器官中的IL-22受體相互作用，在不同的微環(huán)境中執(zhí)行不同的功能[15]。最近的研究證明，滋養(yǎng)細胞上存在IL-22的受體，并且IL-22和其受體結合后可對滋養(yǎng)細胞發(fā)揮調控作用，即可促進滋養(yǎng)細胞的增殖、延長滋養(yǎng)細胞的生存時間并抑制滋養(yǎng)細胞的凋亡[16-17]。到目前為止，關于Th22細胞和IL-22與URSA的關系的報道甚少，為了探究Th22細胞與URSA的關系，筆者通過流式細胞儀檢測了URSA組和對照組孕婦外周血中Th22細胞的數量，在URSA組中我們觀察到數量顯著增多的Th22細胞，在外周血中同樣檢測到濃度升高的IL-22，因此，筆者推測外周血中數量增多的Th22細胞可能與URSA具有一定相關性。但是，Th22細胞和細胞因子IL-22在不同的細胞、組織和器官中具有雙重調控作用。研究表明，IL-22可在多種組織中發(fā)揮免疫保護的作用，它可以通過誘導皮膚防御素、鈣粒蛋白-A和鈣粒蛋白-B的表達增加皮膚角質形成細胞的抗菌能力，同時在病毒性肝炎中可保護肝臟細胞并修復肝損傷，此外，在潰瘍性結腸炎中，能夠加速創(chuàng)面的愈合，發(fā)揮保護創(chuàng)面的功能[18-20]。然而，Th22細胞和IL-22并非只發(fā)揮免疫保護的功能，研究發(fā)現其與多種自身免疫性疾病、炎癥性疾病和癌癥的發(fā)病密切相關[21-22]。有資料顯示，IL-22作為促炎性細胞因子參與類風濕關節(jié)炎的發(fā)病，并且疾病的嚴重程度與Th22細胞的數量呈正相關[23]。因此，考慮到Th22細胞和IL-22作用的復雜性，本研究僅僅初步觀察到了在URSA中，Th22細胞的數量是增多的，至于增多的Th22細胞在URSA中如何發(fā)揮作用，仍需深入研究。

關于Th17細胞與URSA關系的報道較多，目前較多的研究認為在URSA患者外周血中和蛻膜中Th17細胞的數量是增多，這與本研究中在URSA患者外周血中所觀察到的結果是一致的。Th17細胞數量的增多，其所分泌的細胞因子IL-17A增多，IL-17A作用廣泛，可以誘導多種炎性細胞因子（IL-23、IL-6、TNF-α）和多種趨化因子（巨噬細胞趨化蛋白-1、巨噬細胞炎性趨化因子-2、基質金屬蛋白酶等），這些效應因子可進一步誘發(fā)炎癥反應，介導組織浸潤和組織損傷，從而不利于妊娠的維持[24-25]。此外，本研究重點分析了Th22細胞與Th17細胞的關系，以往的研究表明，Th22細胞與Th17細胞關系密切，在類風濕性關節(jié)炎、宮頸癌和再生障礙性貧血等多種疾病中相互影響，表現為共同的變化趨勢，在類風濕關節(jié)炎中，Th22細胞與Th17細胞的數量均增多，且兩者之間存在正相關關系，同時Th17細胞的轉錄因子RORγt可調控Th22細胞的分化[23，26-27]。在本研究中，筆者應用了pearson相關分析法分析了兩組孕婦外周血中Th22細胞與Th17細胞的相關性，發(fā)現在URSA組中，Th22細胞的數量與Th17細胞的數量呈明顯的正相關，而在對照組中，則沒有觀察到顯著的相關性，因此，筆者推測在URSA中，Th22細胞和Th17細胞的分化成熟，可能相互影響，具有共同的驅動方式。

IL-22是IL-10細胞因子家族中的一員，主要由活化后的T細胞分泌，Th22細胞、Th17細胞、Th1細胞、細胞毒性T細胞和自然殺傷細胞都可分泌IL-22[28]。有資料顯示，在所有分泌IL-22的細胞中，Th22細胞所占的比例最大，為37%～63%，Th17細胞所占的比例是10%～18%[9]。由此可見，Th22細胞是主要分泌IL-22的細胞群體，這就為本研究中觀察到URSA患者外周血中的IL-22的濃度與Th22細胞的數量呈正相關提供了支持，由此推測濃度升高的IL-22可能主要來源于Th22細胞。然而，在URSA組中，IL-22的濃度不僅與Th22細胞的數量呈正相關，也與Th17細胞的數量呈正相關，但與Th22細胞的關聯系數較大，關聯性較強，同時，在URSA組中CD4+IL-17A+IL-22+雙陽性細胞（分泌IL-22的Th17細胞）的數量較對照組顯著增多，雖然這一細胞群體所占的比例很少，但是這足以說明，在URSA中，除Th22細胞之外，濃度增多的IL-22可能同時來源于Th17細胞，只是Th17細胞所占的比例很小。然而，IL-22與Th22細胞和Th17細胞的關系不僅僅限于此，我們仍然需要進一步去探究IL-22如何在URSA中發(fā)揮作用，以及其與其他細胞和細胞因子之間的關系。

綜上所述，Th22細胞的數量及其效應因子IL-22濃度的顯著增高可能與URSA具有一定相關性，同時Th22細胞與Th17細胞呈相關，提示兩種細胞的分化成熟，可能相互影響，具有共同的驅動方式。此外，在URSA中，IL-22可能同時來源于Th22細胞和Th17細胞，但究竟IL-22是如何發(fā)揮作用的，以及其與兩種細胞之間的潛在關系，仍需要深入探究。

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