張志軍,邢磊，岳杰，劉佳，尹花

(啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島啤酒股份有限公司，山東 青島, 266100)

酒花(HumlnusLupulus)為大麻科葎草屬多年生蔓性草本植物，雌雄異株，雌花是啤酒釀造重要的組成成分。酒花被譽(yù)為“啤酒釀造的靈魂”，不僅賦予啤酒爽口的苦味和獨(dú)特的酒花香氣，還有穩(wěn)定泡沫、防腐和提高非生物穩(wěn)定性的作用。不同品種酒花在樹脂、酒花油成分上差異較大，直接影響啤酒的風(fēng)味和口感[1]。因此在酒花品種的選育、種植、加工、使用過程中，品種真實(shí)性鑒定對(duì)于酒花種植者、經(jīng)銷商和啤酒企業(yè)而言都是至關(guān)重要的判定指標(biāo)。

經(jīng)過多年的發(fā)展，酒花品種鑒定主要包括形態(tài)鑒別法、化學(xué)成分分析法和DNA分子標(biāo)記法。傳統(tǒng)的酒花形態(tài)鑒別主要是基于酒花種植的農(nóng)學(xué)特征、酒花球果形態(tài)來識(shí)別酒花品種，而酒花采摘后經(jīng)烘干、粉碎、制粒加工，已經(jīng)無法區(qū)分形態(tài)特征?；瘜W(xué)分析法是將酒花苦味酸[2]，精油成分[3-5]或其他酒花成分等[6]作為品種區(qū)分的依據(jù)，但化學(xué)成分易受種植和貯藏條件等因素的影響[7-8]。DNA分子標(biāo)記不受土壤、氣候和貯運(yùn)等因素的影響，但已報(bào)道的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)[9-10]和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)[11]2種方法，具有標(biāo)記顯性遺傳和重復(fù)性低等缺點(diǎn)[12-13]。微衛(wèi)星(simple sequence repeats，SSR)作為第二代分子標(biāo)記，具有多態(tài)性豐富、共顯性遺傳和擴(kuò)增模式簡(jiǎn)單等特征[14]，已成為大麥[15-17]、小麥[18-19]等農(nóng)作物品種鑒定的主要方法，在酒花品種鑒定上也有研究報(bào)道[20-21]。PATZAK等[20]基于聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用30對(duì)SSR引物對(duì)11個(gè)酒花品種進(jìn)行鑒定；HORREO等[21]利用毛細(xì)管電泳對(duì)生長(zhǎng)在西班牙西北部(加利西亞)的野生啤酒花進(jìn)行遺傳多樣性分析。目前SSR分子標(biāo)記主要使用聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳2種檢測(cè)平臺(tái)，由于毛細(xì)管電泳具有高效、快速、微量、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，已成為SSR分子標(biāo)記的主流檢測(cè)平臺(tái)。然而毛細(xì)管電泳檢測(cè)時(shí)要求擴(kuò)增片段標(biāo)記熒光染料，尤其在引物篩選階段，如果對(duì)上百對(duì)引物進(jìn)行熒光標(biāo)記則引物成本較高，影響實(shí)際應(yīng)用。TP-M13-SSR(simple sequence repeat with tailed primer M13)分子標(biāo)記法作為一種低成本分析技術(shù)，在正向引物5′端標(biāo)記M13尾巴序列，僅對(duì)M13通用引物進(jìn)行熒光標(biāo)記，引物合成成本大幅降低。該技術(shù)目前已在蘋果、玉米、枸杞等農(nóng)作物的種質(zhì)資源多樣性研究方面進(jìn)行了廣泛的報(bào)道[22-27]，但在酒花品種鑒定方面尚無相關(guān)的研究報(bào)道。

本研究基于SSR熒光標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳，從大量引物篩選中選擇多態(tài)性豐富的引物用于酒花品種指紋圖譜構(gòu)建，目的是建立一種快速、準(zhǔn)確的酒花品種真實(shí)性鑒定技術(shù)，為酒花在種植、加工、采購(gòu)環(huán)節(jié)提供品種區(qū)分和品種產(chǎn)權(quán)保護(hù)方面的技術(shù)支持，從源頭上保障酒花產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青島大花、Hersbruker、Saaz、Cascade等18個(gè)酒花品種共126個(gè)樣品由啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室收集，品種及產(chǎn)地見表1。為保證品種純度的可靠性，上述酒花品種主要收集單株酒花的球果和葉片樣品。待測(cè)樣品為3個(gè)酒花公司送檢的5份Cascade商業(yè)酒花樣品(顆粒酒花)，分別標(biāo)記為T1～T5，進(jìn)行品種真實(shí)性鑒定。

TaqDNA聚合酶，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；dNTPs，美國(guó)Thermo Scientific公司；GeXP遺傳分析系統(tǒng)試劑，美國(guó)Sciex公司；植物DNA提取試劑盒，北京百泰克公司；熒光引物，北京英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 酒花品種及產(chǎn)地Table 1 Hop varieties and origin

1.2 儀器與設(shè)備

96通道高通量核酸提取儀，北京百泰克公司；C1000 TouchTMPCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；GenomeLabTMGeXP遺傳分析系統(tǒng)，美國(guó)Sciex公司；CK1000D高通量組織研磨儀，北京托摩根公司；5430型離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

稱取30 mg酒花球果樣品，置于2.0 mL離心管中，加一顆5 mm鋼珠，利用高通量組織研磨儀1100 r/min粉碎1 min。按照植物DNA提取試劑盒步驟進(jìn)行DNA提取，利用Nano Drop 2000對(duì)DNA濃度與純度進(jìn)行檢測(cè)。提取的DNA統(tǒng)一稀釋到20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物篩選

根據(jù)相關(guān)報(bào)道[28-31]，選擇103對(duì)SSR引物作為本研究的候選引物進(jìn)行多態(tài)性引物篩選。正向引物的5'端與M13序列相連合成TP-M13正向引物，M13通用引物在5′端用Alexa Fluor 750熒光進(jìn)行標(biāo)記，引物序列TGTAAAACGACGGCCAGT，反向引物為正常引物。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系：2 μL 10×PCR Buffer，3 μL 25 mmol/L MgCl2，2 μL 2 mmol/L dNTP，0.4 U Taq DNA聚合酶，1 μL 0.8 μmol/L正向引物，1 μL 3.2 μmol/L反向引物，1 μL 3.2 μmol/L M13通用引物，1 μL 20 ng/μL模板DNA，滅菌去離子水補(bǔ)足到20 μL。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共31個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.4 毛細(xì)管電泳檢測(cè)取

0.5 μL分子質(zhì)量?jī)?nèi)標(biāo)加入39.5 μL甲酰胺緩沖液，混合均勻，加入樣品板中。取1 μL稀釋后的PCR產(chǎn)物加入上樣板中，石蠟油覆蓋防止揮發(fā)，緩沖液板中添加3/4體積分離緩沖液。毛細(xì)管電泳進(jìn)樣電壓2.0 kV，時(shí)間30 s，90 ℃變性2 min，分離電壓6.0 kV，分離時(shí)間35 min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

PCR產(chǎn)物分離過程中，GeXP遺傳分析系統(tǒng)利用GeneMapper-V3.0軟件對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行收集、儲(chǔ)存，參照分子質(zhì)量?jī)?nèi)標(biāo)得到圖譜中各片段的大小。通過人工分析將電泳圖譜中的特征峰判讀為對(duì)應(yīng)的等位基因，取3次重復(fù)的平均值并四舍五入取整數(shù)，作為該品種的等位基因大小。電泳圖譜中的單峰(純合型)用X表示，雙峰(雜合型)的主峰和次峰用X/Y表示，根據(jù)各品種等位基因大小進(jìn)行品種DNA指紋數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及多態(tài)性分析

利用18個(gè)酒花品種進(jìn)行引物篩選，每個(gè)品種選擇3個(gè)代表性樣品，綜合考慮等位基因數(shù)量、峰值特征情況，從103對(duì)候選引物中篩選到11對(duì)多態(tài)性豐富的SSR引物，引物序列信息見表2。

表2 引物序列信息Table 2 Information of primer sequences

11對(duì)引物在18個(gè)酒花品種上共檢測(cè)到69個(gè)等位基因，每對(duì)引物的等位基因數(shù)量3～11個(gè)不等，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出6.3個(gè)等位基因。引物HlGT1多態(tài)性最豐富，含有11個(gè)等位基因；引物HlGA4多態(tài)性最低，含有3個(gè)等位基因。通常情況下引物擴(kuò)增產(chǎn)物的等位基因越多，則該引物的品種區(qū)分能力越大。此外，引物等位基因數(shù)量與可直接區(qū)分品種的數(shù)量也有一定關(guān)系，引物HlGT1含有的11個(gè)等位基因可單獨(dú)區(qū)分8個(gè)酒花品種，如Saaz、Perle、Hallertauer、Magunum、Nugget、Columbus、Northern Brewer和麒麟豐綠；而引物HLC-001D含有5個(gè)等位基因，只能區(qū)分麒麟豐綠一個(gè)品種；引物HlGA4含有3個(gè)等位基因，無法區(qū)分任何一個(gè)品種。因此僅靠一對(duì)引物難以區(qū)分全部酒花品種，只有通過引物間的相互組合才能實(shí)現(xiàn)可區(qū)分品種數(shù)量的最大化。引物HlGT1可單獨(dú)區(qū)分8個(gè)品種，其與引物3a88組合后，二者可區(qū)分品種增加到14個(gè)，在18個(gè)品種中區(qū)分率達(dá)到82.3%，在全部?jī)蓪?duì)引物的組合中HlGT1和3a88組合的鑒定效率最高。相比較而言，引物HLC-001D和HlGA4組合后只能區(qū)分5個(gè)品種，區(qū)分率僅29.4%。通過最優(yōu)引物組合設(shè)計(jì)，在引物3a88和HlGT1組合的基礎(chǔ)上增加HLC-001D和HlGA4后可實(shí)現(xiàn)全部18個(gè)酒花品種的區(qū)分，區(qū)分率100%。因此將引物3a88、HlGT1、HLC-001D和HlGA4作為酒花品種鑒定的核心引物，其他7對(duì)引物作為擴(kuò)展引物用于輔助驗(yàn)證提高鑒定的準(zhǔn)確性。

DNA指紋圖譜是指某一品種的特異性DNA片段(特征峰)，按照固定的引物順序排列后構(gòu)成的該品種特有的譜圖。利用篩選的4對(duì)核心引物(3a88、HlGT1、HLC-001D和HlGA4)對(duì)18個(gè)品種的126個(gè)酒花樣品進(jìn)行指紋圖譜分析，并對(duì)所有供試樣品的品種真實(shí)性進(jìn)行判定。圖1為國(guó)產(chǎn)青島大花在4對(duì)引物下的指紋圖譜，圖2為捷克Saaz香花的指紋圖譜。引物HLC-001D的毛細(xì)管電泳圖譜中青島大花的特征峰為213 bp，Saaz香花為196/213 bp；引物3a88的電泳圖譜中青島大花的特征峰為249/259 bp，Saaz香花為247 bp；引物HlGT1的圖譜中青島大花特征峰為177/203 bp，Saaz香花為195 bp。引物HlGA4的圖譜中青島大花為281 bp，Saaz香花為279 bp。結(jié)果表明，4對(duì)引物擴(kuò)增片段范圍均勻分布在150～300 bp，各引物特征峰明顯，非特異性峰較少，適合種指紋圖譜分析。

圖1 青島大花的指紋圖譜Fig.1 The fingerprint of Tsingtao flower

圖2 Saaz的指紋圖譜Fig.2 The fingerprint of Saaz

2.2 酒花品種指紋數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建與驗(yàn)證

利用4對(duì)核心引物對(duì)18個(gè)品種的酒花樣品進(jìn)行分析，在已構(gòu)建酒花品種指紋圖譜的基礎(chǔ)上，將單一品種的指紋數(shù)據(jù)按特定的引物順序進(jìn)行排列，匯總后得到各酒花品種的指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，見表3。

由表3可知，不同品種酒花的指紋數(shù)據(jù)差異大小不等，某些品種的指紋數(shù)據(jù)差別較大，如青島大花的特征指紋數(shù)據(jù)為213、249/259、177/203、281 bp，麒麟豐綠為202、251、174/197、283 bp，2個(gè)品種在4對(duì)引物上差異明顯，使用任何一對(duì)引物都能加以區(qū)分。而某些品種的指紋數(shù)據(jù)比較接近，只在個(gè)別等位基因上有差異，需要多引物組合后才能區(qū)分，如德國(guó)酒花Hallertauer、Hersbruker和Tradition。引物多態(tài)性分析表明，4對(duì)核心引物在18個(gè)酒花品種上共擴(kuò)增出28個(gè)等位基因，每對(duì)引物的等位基因數(shù)量3～11個(gè)不等，平均等位基因數(shù)量為7.0個(gè)。其中引物HlGT1多態(tài)性最豐富，在159～203 bp包括11個(gè)等位基因；引物3a88多態(tài)性其次，在239～259 bp有9個(gè)等位基因；引物HlGA4多態(tài)性最低，在279～283 bp僅有3個(gè)等位基因。

表3 酒花品種指紋數(shù)據(jù)庫(kù) 單位：bp

在對(duì)未知酒花樣品進(jìn)行品種鑒定時(shí)，通過DNA提取、PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳分離、圖譜分析后得到樣品指紋數(shù)據(jù)，將其與目標(biāo)酒花品種的標(biāo)準(zhǔn)指紋數(shù)據(jù)比對(duì)即可確定所屬品種，實(shí)現(xiàn)品種真實(shí)性鑒定。以3個(gè)商業(yè)酒花公司提供的5份Cascade樣品鑒定為例，常規(guī)指標(biāo)分析表明5份樣品的甲酸和酒花油含量差異較大，因此廠家對(duì)品種的真實(shí)性存疑。鑒定結(jié)果表明，樣品T1～T5在核心引物(HLC-001D、3a88、HlGT1、 HlGA4)下的指紋數(shù)據(jù)與對(duì)照Cascade酒花的標(biāo)準(zhǔn)指紋數(shù)據(jù)完全一致，說明5份樣品均為Cascade，樣品來源真實(shí)可靠。研究過程中發(fā)現(xiàn)，建庫(kù)收集的個(gè)別酒花樣品的指紋數(shù)據(jù)與所標(biāo)識(shí)的品種名稱并不一致，可能是由于樣品在種植、取樣、運(yùn)輸過程中出現(xiàn)信息錯(cuò)誤導(dǎo)致的。

基于最少引物鑒定最多品種的指紋圖譜構(gòu)建原則[10]，在品種數(shù)量一定的情況下，需對(duì)大量引物進(jìn)行片段分析和多態(tài)性驗(yàn)證，篩選的引物數(shù)量越少則鑒定效率越高，因此核心引物篩選是整個(gè)品種鑒定的關(guān)鍵。首先，引物篩選的基本原則在于選擇等位基因數(shù)量多的引物。其次，對(duì)不同引物的區(qū)分能力進(jìn)行排列組合，優(yōu)選數(shù)量最少、擴(kuò)增穩(wěn)定的引物為核心引物。最后，將多引物整合在多重PCR反應(yīng)體系中，擴(kuò)增片段通過標(biāo)記不同顏色熒光和片段大小進(jìn)行區(qū)分，從而縮短檢測(cè)時(shí)間、降低成本。該數(shù)據(jù)庫(kù)具有擴(kuò)展性，今后的研究需要豐富國(guó)內(nèi)及全球的酒花品種，新品種的納入可不斷擴(kuò)大數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定能力，通過構(gòu)建多重PCR反應(yīng)體系，進(jìn)一步提高檢測(cè)效率。

3 結(jié)論

本研究基于TP-M13-SSR熒光標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)，從103對(duì)候選引物中篩選得到11對(duì)多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的引物，通過引物組合設(shè)計(jì)，確定了4對(duì)核心引物構(gòu)建的18個(gè)國(guó)內(nèi)外主要酒花品種指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，共檢測(cè)到28個(gè)等位基因，各引物等位基因數(shù)量3～11個(gè)不等，每對(duì)引物平均產(chǎn)生7.0個(gè)等位基因。酒花品種指紋數(shù)據(jù)的構(gòu)建及其品種真實(shí)性鑒定，在酒花品種選育、田間種植、新品種產(chǎn)權(quán)保護(hù)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，為酒花種植者、生產(chǎn)者、啤酒企業(yè)提高品種選育、田間管理和品質(zhì)評(píng)價(jià)能力提供了技術(shù)支持。