花生耐鹽乙烯不敏感突變體的篩選

孫明明　周文杰　紀紅昌　黃建斌　趙方貴　唐艷艷　朱虹　姜德鋒　喬利仙

摘要：利用沙土培養(yǎng)法，使用1、3、5、7、10 mg·L-1乙烯利溶液處理花生品種花育22種子，5 d后測量下胚軸長度。結果表明：經乙烯利處理后，花生下胚軸生長受到顯著抑制而增粗變短，受抑制程度隨乙烯利溶液濃度的提高而增加，3 mg·L-1乙烯利處理的下胚軸長度極顯著低于未施加和施加1 mg·L-1乙烯利處理的，因此選用3 mg·L-1乙烯利對誘變篩選得到的165 份花生種質進行種子萌發(fā)處理，有145 份種質表現為下胚軸生長受抑制而增粗變短，屬于正常的乙烯敏感型種質;有11 份種質下胚軸生長并未受到明顯抑制，顯著高于同樣條件處理下花育22的下胚軸長度，屬于乙烯不敏感型種質;有9 份種質下胚軸生長受到顯著抑制，其下胚軸長度極顯著低于同樣條件處理下花育22的下胚軸長度，屬于乙烯超敏感型種質。使用50 μmol·L-1 ACC（1-氨基環(huán)丙烷羧酸）溶液對篩選獲得的11 份不敏感種質進行驗證處理，其中，9 份種質保持了對乙烯不敏感的特點，下胚軸生長仍未受到明顯抑制。通過在沙土中添加0.7% NaCl溶液，繼續(xù)對篩選得到的9份乙烯不敏感型種質進行耐鹽篩選，有1份種質表現為下胚軸生長受抑制程度最低，下胚軸長度顯著高于同樣處理條件下花育22的下胚軸長度，初步確定其為耐鹽乙烯不敏感種質。因此，用3 mg·L-1乙烯利溶液預選、50 μmol·L-1 ACC溶液驗證、0.7% NaCl溶液處理，通過評價黑暗條件下沙土培養(yǎng)的花生種子下胚軸長度，可以有效篩選到花生耐鹽乙烯不敏感突變體。

關鍵詞：花生;乙烯利;ACC（1-氨基環(huán)丙烷羧酸）;不敏感突變體;耐鹽

中圖分類號：S565.203.4文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）09-0132-07

Screening of Peanut Mutants with Salt Tolerance and Ethylene Insensitivity

Sun Mingming2， Zhou WenjieJi HongchangHuang JianbinZhao Fanggui2，

Tang Yanyan Zhu HongJiang DefengQiao Lixian1

（1.College of Agronomy， Qingdao Agricultural University/Shandong Peanut Industry Cooperative Innovation Center/Shandong

Key Laboratory of Dry-Land Farming Technology， Qingdao 266109， China; 2. College of Life Sciences， Qingdao Agricultural

University/Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province， Qingdao 266109， China）

Abstract Seeds of peanut cultivar Huayu 22 were cultured in sands with 3， 5， 7 and 10 mg·L-1 ethephon solution， and the hypocotyl length was measured after five days. The results showed that the hypocotyl growth was significantly inhibited and got shorter and weaker after treated with ethephon， and the inhibition increased with the increasing concentration of ethephon solution. Hypocotyl length treated with 3 mg·L-1 ethephon was significantly shorter than that treated with 1 mg·L-1 ethephon or not，So one hundred and sixty-five peanut germplasm accessions from mutagenesis were treated and screened with 3 mg·L-1 ethephon solution. The obvious hypocotyl growth inhibition was found in 145 accessions which belonged to the ethylene sensitive accessions. The hypocotyl growth of 11 accessions were not inhibited obviously， and were significantly higher than that of Huayu 22 under the same treatment， which belonged to the ethylene insensitive accessions. The significantly obvious hypocotyl growth inhibition was found in 9 accessions with the hypocotyl length significantly lower than that of Huayu 22 under the same treatment， which belonged to the ethylene super sensitive accessions. The seeds of selfed progenies from 11 insensitive accessions were cultured in sands with 50 μmol·L-1 ACC solution， and there were 9 accessions whose hypocotyl growth was still not inhibited obviously. Salt tolerance screening was conducted by adding 0.7% NaCl solution in sands for the 9 stable insensitive accessions. There was one accession whose hypocotyl growth was obviously higher than that of Huayu 22 under the same treatment， which was regarded as a salt tolerant and ethylene insensitive accession. Therefore， the salt tolerant and ethylene insensitive mutants of peanut could be screened by pre-selection with 3 mg·L-1 ethephon solution， validation with 50 μmol·L-1 ACC solution，treating with 0.7% NaCl solution and evaluating the hypocotyl length of peanut seeds cultured in sandy soil under dark conditions.

Keywords Peanut （Arachis hypogaea L.）; Ethephon; ACC （1-aminocyclopropanecarboxylic acid）; Insensitive mutant; Salt tolerance

花生（Arachis hypogaea L.）是重要的油料作物和經濟作物[1]。由于盲目施用化肥、不合理輪作、灌溉面積擴大等原因，中國土壤次生鹽漬化現象日趨嚴重[2，3]。土壤鹽漬化已成為限制全世界農業(yè)生產的重要因素之一[4]，提高農作物對鹽脅迫的抗性是農業(yè)生產中減輕鹽脅迫不良影響的有效措施，其中篩選耐鹽種質資源并加以利用是最有效的途徑[5]。

乙烯是重要的植物激素之一，不僅調節(jié)植物生長發(fā)育，而且在植物逆境脅迫應答中發(fā)揮重要作用。乙烯對植物生長具有抑制莖伸長、促進莖或根增粗以及使莖橫向生長三方面效應，稱為植物對乙烯響應的“三重反應”。在擬南芥中，乙烯組成型突變體在無乙烯存在的條件下亦表現“三重反應”，而乙烯不敏感突變體在乙烯存在時不表現“三重反應”[6]。鹽脅迫是影響植物生長最主要的逆境因素之一，乙烯作為一種逆境脅迫響應激素在植物抗鹽過程中起著重要作用。一定水平的乙烯合成速率有利于增強植物體的鹽脅迫抗性，例如，乙烯合成前體ACC處理可以顯著增加野生型擬南芥幼苗在高鹽環(huán)境下的抗鹽能力和成活率[7]。據報道乙烯突變體與植物的耐鹽性相關，如在擬南芥中功能獲得型突變體etr1-1在種子萌發(fā)和幼苗階段都表現出對鹽的敏感性，相反功能缺失突變體etr1-7則表現出抗鹽的特征[8-10]。CTR 1是受體下游另一個負調控因子，CTR1 的突變體表現出明顯的高鹽抗性表型，在200 mmol·L-1 NaCl 處理下，ctr1-1的幼苗成活率達到了90%[7]。乙烯應答因子（ethylene-response factors， ERF）也同樣參與了植物的鹽脅迫應答，如ERF類轉錄因子RAP2.6過表達轉基因擬南芥在種子萌發(fā)及營養(yǎng)生長階段能顯著提高植物的抗?jié)B透脅迫能力及耐鹽性等[11]。

花生屬于中度耐鹽作物，開展花生耐鹽性研究，培育耐鹽花生品種，對提高鹽堿地區(qū)花生產量、增加油脂供給具有重要意義。本項目組在前期研究中利用平陽霉素離體誘變結合組織培養(yǎng)及NaCl定向篩選獲得一批花生突變體，部分突變體耐鹽性顯著提高，其自交后代在山東東營鹽堿地表現出耐鹽高產的特點，目前正在參加區(qū)域比較試驗，近年有望推出高產耐鹽新品種[12-14];且基于轉錄組測序差異基因表達分析表明，突變體與對照相比乙烯相關基因表達量存在明顯差異[15]。本研究即以獲得的花生突變體的自交后代為試材，利用乙烯利、ACC和NaCl溶液分別處理沙土培養(yǎng)的花生種子，以下胚軸長度作為評價耐鹽性強弱的指標，建立了一套花生乙烯突變體的篩選方法，并對這些突變材料進行篩選，獲得耐鹽乙烯不敏感突變體，為在花生中進一步闡述乙烯與耐鹽性的相關性提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花生栽培品種花育22（HY22，對照），本項目組前期經平陽霉素誘變處理篩選后所獲得的突變體自交后代種質165 份，由青島農業(yè)大學花生研究中心保存。

1.2 沙培法確定乙烯利篩選濃度

將沙子用自來水清洗干凈，置入滅菌鍋內高溫滅菌（121℃，15 min）后晾干。取1 000 mL的大燒杯若干，每個燒杯中加沙子至700 mL刻度處，備用。設置乙烯利濃度梯度1、3、5、7、10 mg·L- 分別向燒杯中加入各濃度梯度的乙烯利溶液250 mL。每個燒杯種植10 ?；ㄓ?2種子，頂面覆蓋沙子至1 000 mL刻度，用保鮮膜封口，置25℃培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)5 d后，將燒杯上層沙子倒掉，取出萌發(fā)的花生種子，測量下胚軸長度。試驗設3次重復。

1.3 花生乙烯突變體的篩選

使用3 mg·L-1乙烯利溶液對165份花生種質進行處理，處理方法同1.2。對照花育22同時設置水處理及乙烯利處理兩組。重復3次。處理結束后測量每粒種子的下胚軸長度。

1.4 花生乙烯突變體的ACC處理驗證

使用1、10、50 μmol·L-1濃度梯度的ACC溶液對花育22種子進行萌發(fā)處理，根據試驗結果選定50 μmol·L-1 ACC作為篩選驗證濃度。用50 μmol·L-1 ACC溶液對乙烯利溶液篩選獲得的11份種質的自交后代種子進行萌發(fā)處理，處理方法同1.2，設3次重復。對照花育22同時設水處理及ACC處理兩組。

1.5 花生乙烯不敏感突變體的耐鹽性驗證

使用0.1%、0.5%、0.7%濃度梯度的NaCl溶液對花育22種子進行萌發(fā)處理，根據試驗結果選定0.7% NaCl作為篩選濃度。用0.7%的NaCl溶液對篩選獲得的9份乙烯不敏感種質的自交后代種子進行萌發(fā)處理，處理方法同1.2，設3次重復。對照花育22同時設水處理及NaCl處理兩組。

1.6 數據處理與統(tǒng)計分析

試驗數據采用SPSS 21.0進行多重比較和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 乙烯利篩選濃度的確定

沙培法暗培養(yǎng)5 d后取出萌發(fā)的花生種子（圖1）。結果（圖2、圖3）顯示不同濃度乙烯利溶液處理均會極顯著抑制花生下胚軸的伸長，且隨著乙烯利濃度的升高抑制作用增強。未經乙烯利溶液處理的種子下胚軸長度平均為6.24 cm，1 mg·L-1乙烯利溶液處理的下胚軸長度為3.06cm，兩者差異達極顯著水平（P<0.01）;3、5、7、10 mg·L-1乙烯利溶液處理的下胚軸長度分別為1.26、1.16、1.12、0.99 cm，四者間無顯著差異，但均極顯著低于1 mg·L-1乙烯利溶液處理。為了有效提高篩選效果，最終確定3 mg·L-1作為突變體篩選所用的乙烯利濃度。

2.2 花生乙烯突變體的篩選

165份突變種質經3 mg·L-1乙烯利處理后，有145 份種質表現為下胚軸生長受抑制而增粗變短，屬于正常的乙烯敏感型種質;有11份種質（29#、5#、4#、9#等）下胚軸生長并未受到顯著抑制，極顯著高于同樣條件處理下花育22的下胚軸長度，屬于乙烯不敏感型種質;有9 份種質（8#、10#等）下胚軸生長受到顯著抑制，其下胚軸長度極顯著低于同樣條件處理下花育22的下胚軸長度，屬于乙烯超敏感型種質（圖4、圖5）。

2.3 ACC篩選濃度的確定

沙培法暗培養(yǎng)5 d后取出萌發(fā)的花生種子。結果（圖6、圖7）顯示，不同濃度ACC溶液處理均會抑制花生胚軸的伸長，且隨著ACC濃度的升高抑制作用增強。未經ACC溶液處理的種子下胚軸長度平均為6.2 cm，10 μmol·L-1 ACC溶液處理的下胚軸長度為4.1 cm，兩者差異達到極顯著水平（P<0.01）。50 μmol·L-1 ACC溶液處理的下胚軸長度為2.3 cm，極顯著低于10 μmol·L-1 ACC溶液處理。為了盡可能地減少選擇誤差，最終確定50 μmol·L-1作為突變體篩選時的ACC濃度。

2.4 花生乙烯突變體的ACC處理驗證

用50 μmol·L-1 ACC溶液對經乙烯利篩選得到的11份對乙烯不敏感型種質自交后代進行處理，其中9份種質下胚軸生長并未受到明顯抑制，下胚軸長度顯著（P<0.05）高于同樣條件處理下的花育22，可以認定這9份種質為花生乙烯不敏感突變體種質（圖8、圖9）。

2.5 NaCl篩選濃度的確定

沙培法暗培養(yǎng)5 d后取出花生種子。結果（圖10、圖11）顯示，不同濃度NaCl處理均會抑制花生胚軸的伸長，且隨著NaCl濃度的升高抑制作用增強。未經NaCl溶液處理的種子下胚軸長度平均為6.2 cm，0.5% NaCl處理后下胚軸長度為3.8 cm，兩者差異達到極顯著水平（P<0.01）;0.7% NaCl處理的下胚軸平均長度為2.2 cm，極顯著低于0.5% NaCl處理的下胚軸長度。為了盡可能地減少選擇誤差，最終確定0.7%作為突變體篩選時的NaCl濃度。

2.6 花生乙烯不敏感突變體的耐鹽性驗證

對ACC篩選得到的9 份對乙烯不敏感型種質進行0.7% NaCl溶液處理，其中1 份種質下胚軸長度極顯著高于相同處理條件下對照花育22的下胚軸長度（P<0.01）（圖12、圖13），初步認定該種質為花生乙烯不敏感耐鹽突變體種質，命名為M29。

3 討論與結論

在擬南芥及煙草中通常利用在培養(yǎng)基中添加一定濃度的ACC溶液進行乙烯突變體的篩選，由于兩者種子較小，在普通培養(yǎng)皿上即可完成篩選過程。而花生種子較大，受空間限制難以在培養(yǎng)皿中完成篩選試驗?；ㄉ尤~肥厚、營養(yǎng)豐富，萌發(fā)過程只需添加水即可完成，培養(yǎng)基并非必需，加之普通固體培養(yǎng)基透氣性較差，且常規(guī)培養(yǎng)瓶體積較小，無法滿足花生在黑暗條件下胚軸的充分伸長，因此本研究采用沙培法在1 000 mL燒杯中進行花生萌發(fā)試驗，操作簡單且效果好。由于1 000 mL燒杯處理需要使用較多體積的處理液，本研究嘗試使用乙烯利替代ACC進行篩選，然后用ACC進行驗證，結果表明使用乙烯利進行篩選完全可行，且大大降低了篩選成本，適用于大范圍進行乙烯突變體的初步篩選工作。

經乙烯利篩選獲得的11 份乙烯不敏感種質中，有9 份種質后代仍然保持了乙烯不敏感的特點，屬于不再分離的純合體;9 份乙烯超敏感突變體中，僅有1 份種質后代仍然保持了乙烯超敏感的特點，屬于不再分離的純合體，另外8份后代均發(fā)生分離，屬于乙烯超敏感雜合體。關于這些乙烯不敏感與乙烯超敏感突變是屬于同一等位基因突變還是非等位基因突變，仍需進一步的遺傳分析鑒定。9份乙烯不敏感種質中僅有1 份種質后代表現為對NaCl處理的最小生長抑制程度，初步確定其為耐鹽乙烯不敏感種質，后期將通過遺傳雜交及后代分離比例進行進一步的遺傳分析，確認相關基因，并進行相關基因的定位及功能驗證，最終揭示乙烯參與花生耐鹽性的分子機制。

參 考 文 獻：

[1]萬書波. 我國花生產業(yè)面臨的機遇與科技發(fā)展戰(zhàn)略[J].中國農業(yè)科技導報， 2009， 11（1）： 7-12.

[2]于延文，黃榮峰. 乙烯與植物抗逆性[J].中國農業(yè)科技導報，2013， 15（2）： 70-75.

[3]關元秀， 劉高煥， 劉慶生， 等. 黃河三角洲鹽堿地遙感調查研究[J].遙感學報， 2005（1）： 46-52.

[4]Munns R， Tester M. Mechanisms of salinity tolerance[J].Annual Review of Plant Biology， 2008， 59： 651-681.

[5]黃易， 張玉龍. 保護地生產條件下的土壤退化問題及其防治對策[J].土壤通報， 2004，35（2）： 212-216.

[6]Wang F F， Cui X K， Sun Y， et al. Ethylene signaling and regulation in plant growth and stress responses[J].Plant Cell Reports， 2013， 32（7）： 1098-1099.

[7]Achard P， Cheng H， De Grauwe L， et al. Integration of plant responses to environmentally activated phytohormonal signals[J].Science， 2006， 311（5757）： 91-94.

[8]Cao W H， Liu J， Zhou Q Y， et al. Expression of tobacco ethylene receptor NTHK1 alters plant responses to salt stress[J].Plant Cell & Environment， 2006， 29： 1210-1219.

[9]Zhao X C， Schaller G E. Effect of salt and osmotic stress upon expression of the ethylene receptor ETR1 in Arabidopsis thaliana[J].FEBS Letters，2004， 562： 189-192.

[10] Cao W H， Liu J， He X J， et al. Modulation of ethylene responses affects plant salt-stress responses[J].Plant Physiology， 2007， 143： 707-719.

[11] Zhu Q， Zhang J T， Gao X S， et al. The Arabidopsis AP2/ERF transcription factor RAP2.6 participates in ABA， salt and osmotic stress responses[J].Gene， 2010， 457： 1-12.

[12] Zhao M X， Sun H Y， Ji R R， et al. In vitro mutagenesis and directed screening for salt-tolerant mutants in peanut[J].Euphytica， 2013， 189： 161-172.

[13] 喬利仙， 隋炯明， 趙麗蘭， 等. 平陽霉素離體誘變花生M2代農藝性狀分析[J].核農學報， 2014， 28（6）： 955-960.

[14] 王亞， 喬利仙， 武秀玲， 等. 平陽霉素誘變與NaCl定向篩選對花生后代產量和品質性狀的影響[J].華北農學報， 2015， 30（1）： 202-206.

[15] Sui J M， Jiang P P， Qin G L， et al. Transcriptome profiling and digital gene expression analysis of genes associated with salinity resistance in peanut[J].Electronic Journal of Biotechnology， 2018， 32： 19-25.

收稿日期：2019-08-27

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃項目（2018GNC111014）;農業(yè)部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室開放課題基金項目（KF2018008）

作者簡介：孫明明（1987—），男，山東海陽人，碩士研究生，主要從事遺傳學方向研究。E-mail：932454855@qq.com

通訊作者：喬利仙（1973—），女，山西太谷人，博士，教授，主要從事花生生物技術育種研究。E-mail： lxqiao73@163.com