大豆蛋白和豌豆蛋白對體外發(fā)酵特性及合成微生物蛋白的影響

梁婷婷 佟立濤 耿棟輝 王麗麗 蒲華寅 周閑容 黃峻榕 周素梅*

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100193

2 陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院 西安 710021）

人類胃腸道中復(fù)雜而動(dòng)態(tài)平衡的微生物區(qū)系對宿主的健康和營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收起著重要的作用[1-2]。蛋白質(zhì)作為最重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，對腸道健康的影響愈來愈受到人們的關(guān)注。目前，一些研究發(fā)現(xiàn)不同水平蛋白對腸道內(nèi)微生物的組成和數(shù)量會有影響[3]。Pieper等[4]認(rèn)為，在飼糧中增加蛋白質(zhì)水平，不改變豬糞便中pH值。Geypens等[5]研究發(fā)現(xiàn)飼糧中蛋白質(zhì)的添加可顯著增加糞便中氨態(tài)氮（Ammonia Nitrogen，NH3-N）濃度。Le等[6]將飼糧蛋白質(zhì)水平從18%降至12%，顯著降低了豬糞便中短鏈脂肪酸 （Short chain fatty acid，SCFA）和支鏈脂肪酸 （Branched chain fatty acid，BCFA）濃度，且不同水平蛋白質(zhì)底物對豬結(jié)腸微生物體外發(fā)酵特性和菌體蛋白合成（Microbial Crude Protein，MCP）能力都有一定的影響[7]。目前有關(guān)不同來源的蛋白質(zhì)底物對微生物體外發(fā)酵代謝產(chǎn)物的影響研究報(bào)道甚少。

哈佛醫(yī)學(xué)院和馬薩諸塞州總醫(yī)院的研究人員對超過13萬人的追蹤調(diào)查顯示，食用較多來自植物的蛋白質(zhì)，有助于降低死亡率。如果攝入較多來自動(dòng)物的蛋白質(zhì)，就會使死亡風(fēng)險(xiǎn)上升[8]?！吨袊悄虿♂t(yī)學(xué)營養(yǎng)治療指南》指出：植物來源的蛋白質(zhì)，尤其是大豆蛋白，相比動(dòng)物蛋白更有助于降低血脂水平[9]。鄧士賢[10]稱豌豆蛋白所含的氨基酸組成與大豆蛋白相近，接近人體的需要，其中豌豆中含有谷類食物中較為缺乏的賴氨酸，豌豆蛋白具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。大豆蛋白與豌豆蛋白作為植物蛋白中的優(yōu)質(zhì)蛋白，其消化與吸收也受到很多研究者的密切關(guān)注。此外，酪蛋白與植物蛋白和其它動(dòng)物蛋白相比，其消化、吸收、利用率很高，通常作為評定其它蛋白生物學(xué)價(jià)值的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。本文旨在體外厭氧培養(yǎng)的條件下，研究比較大豆蛋白、豌豆蛋白與酪蛋白對人體糞便微生物發(fā)酵主要代謝產(chǎn)物 （揮發(fā)性脂肪酸 （Volatile Fatty Acid，VFA））以及合成菌體蛋白（MCP）能力的影響，旨在為進(jìn)一步探討大豆蛋白和豌豆蛋白對人體腸道健康的影響提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆蛋白，豌豆蛋白由煙臺東方蛋白科技有限公司提供；酪蛋白由北京諾康源生物科技有限公司提供；胃蛋白酶（474 U/mg）、胰酶（4×USP）均由Sigma公司提供；氫氧化鈉、氯化鉀、氯化鈉等均為分析純，由國藥集團(tuán)提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 體外消化 體外消化過程參照Wendy等[11]的方法，并略作修改。將1 g原料蛋白中加入20 mL的蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的溶液，煮沸2 min，冷卻后，用1 mol/L的HCl調(diào) pH 至 2.0，加入0.04 g胃蛋白酶（占底物質(zhì)量的4%），37℃恒溫反應(yīng)1 h；用0.9 mol/L的NaHCO3將溶液的pH調(diào)至 5.3，再用 1 mol/L的NaOH 調(diào) pH 至 7.0，加入0.04 g胰蛋白酶（占底物質(zhì)量的4%），37℃恒溫反應(yīng)2 h，沸水浴10 min終止反應(yīng)，分別在消化過程中（0，30，60，90，120，180 min）取樣用于水解度的測定。最后將樣品冷凍干燥，保存用于體外模擬腸道發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.2 水解度 （DH）的測定 采用鄰苯二甲醛（OPA）法[12]，將 5 mL試管中加入 3.00 mL OPA 溶液，再加入400 μL稀釋至一定倍數(shù)的水解上清液，室溫下反應(yīng)2 min后在340 nm處測定吸光值。同時(shí)用絲氨酸（Serine）標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.9516 mmol/L）做參考，用水做空白試驗(yàn)。計(jì)算公式如下：

式中：Serine NH2——每克蛋白質(zhì)中含serine NH2的質(zhì)量；X——樣品質(zhì)量（g）；P——樣品中的蛋白含量（%）；N——稀釋倍數(shù)；V——上清液體積（L）。

式中：htot、β、α——常數(shù)；htot——每克原料蛋白的肽鍵的物質(zhì)的量（mmol/g）。大豆蛋白，豌豆蛋白β、α分別以0.342和0.970表示，htot=7.8；酪蛋白β、α分別以0.40和1.00表示，htot=7.6。

1.2.3 模擬腸道發(fā)酵 培養(yǎng)液配制：參照Theodorou等[13]的方法，并略作修改。需要預(yù)先配制A、B、C、D和E 5種溶液。其配制方法如表1。模擬腸道發(fā)酵參照Olano-Martin等[14]的方法，并略作修改。無菌發(fā)酵瓶中加入36 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)其pH值至7.0，收集健康志愿者的新鮮糞便，志愿者為23～24歲的健康男性，3個(gè)月內(nèi)未接受抗生素治療，取樣前未攝入益生元或益生素，并且無腸道疾病史，收集過程盡量保持無菌狀態(tài)。糞便收集后立即用預(yù)還原的磷酸鹽緩沖液（PBS，1 mmol/L，pH 7.0）按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%比例稀釋。

取4 mL糞便稀釋液加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，隨后按照質(zhì)量濃度為0.25 g/L的比例加入體外消化后的凍干樣品，將樣品加入混勻后在37℃厭氧工作站中發(fā)酵，空白組中僅加入相同體積糞漿。在發(fā)酵的第0，24，48 h取樣用于pH值，氨態(tài)氮，微生物蛋白，揮發(fā)性脂肪酸的測定。從糞便采集至樣品加入在30 min內(nèi)完成，每個(gè)樣品重復(fù)2次。

1.2.4 pH的測定 將發(fā)酵液在9 000 r/min下離心10 min，取其上清液裝入離心管中，pH計(jì)測定發(fā)酵上清液的pH值。

1.2.5 氨態(tài)氮測定 參照Weathbum等[15]和Broderick等[16]方法，并略作修改，測定NH3-N濃度，將發(fā)酵液與0.2 mol/L鹽酸等體積混合，于-20℃保存。測定前解凍，于4℃條件下，10 000 r/min離心10 min，取上清液采用比色法進(jìn)行測定分析。

1.2.6 微生物蛋白測定 考馬斯亮藍(lán)比色法測定MCP濃度[17]，-20℃凍存的發(fā)酵液樣品室溫下解凍，取3 mL樣品1 000 r/min離心，然后取2 mL上清液15 000 r/min離心30 min。100 μL上清液加入到5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液中，在595 nm波長下讀取吸光度值。以結(jié)晶牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 揮發(fā)性脂肪酸測定 采用氣相色譜方法測定揮發(fā)性脂肪酸（VFA）[18]：取發(fā)酵液樣品1 mL加0.2 mL 25%偏磷酸1 mL，-20℃冰箱保存。測定前解凍，12 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL測定。柱溫110℃，進(jìn)樣器溫度180℃。檢測器溫度180℃。配制乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸混標(biāo)，梯度稀釋，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行定性定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013初步處理，用SPSS19.0單因子方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著，用Origin進(jìn)行作圖。

表1 培養(yǎng)基配制方法Table1 The method of preparation of culture medium

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源蛋白體外模擬胃腸消化產(chǎn)物的水解度（DH）的變化

蛋白質(zhì)的水解度（degree of hydrolysis，DH），即測定生成的有效蛋白肽。圖1a為酪蛋白、大豆蛋白和豌豆蛋白被胃蛋白酶、胰蛋白酶消化水解的進(jìn)程曲線。前60 min為胃蛋白酶水解階段，60～180 min為胰蛋白酶水解階段，蛋白消化液的水解度隨消化時(shí)間的增加而增加，到120 min左右，3種蛋白消化產(chǎn)物基本達(dá)到最高水解度，之后變化較緩慢。這是因?yàn)殡S著消化反應(yīng)的進(jìn)行，消化產(chǎn)物濃度增大，底物濃度減小，蛋白酶的活性受到抑制等綜合因素所致[19]。Gilbert等[20]稱來源于動(dòng)物的蛋白質(zhì) （如乳品和動(dòng)物蛋白）其消化率可能高達(dá)90%，高于植物蛋白，這說明酪蛋白更易被水解。蔡立志等[21]又稱大豆蛋白飲品比牛奶容易消化吸收，植物蛋白中，大豆蛋白最接近于動(dòng)物蛋白和“全價(jià)蛋白”，且沒有動(dòng)物蛋白的一些副作用[22]，這說明大豆蛋白也容易被水解。由圖1（b）顯示可知，3種蛋白經(jīng)過體外消化最終水解度有一定的差別，大豆蛋白和酪蛋白水解度顯著高于豌豆蛋白（P＜0.01），大豆蛋白水解度與酪蛋白差異不顯著（P＞0.05），本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。

圖1 體外模擬胃腸消化酶解3種蛋白的水解度變化Fig.1 The changes in degree of hydrolysis of casein，soybean，pea after stimulated in vitro gastrointestinal digestion

2.2 不同來源蛋白對人體糞便微生物發(fā)酵液中pH的影響

夏楠等[23]報(bào)道稱微生物適宜生活的pH為6～7之間，在這范圍內(nèi)最有利于蛋白質(zhì)的降解。由圖2a可知，本試驗(yàn)pH介于6.43～6.87，基本處于中性環(huán)境，在適宜微生物生活的范圍內(nèi)，且對照組在發(fā)酵期間pH基本保持不變，蛋白質(zhì)底物添加組的發(fā)酵液中pH整體呈現(xiàn)先下降后增長的趨勢。短鏈脂肪酸是細(xì)菌在人的結(jié)腸發(fā)酵產(chǎn)生的主要代謝物，由于產(chǎn)酸會降低pH值，因此pH值的變化常用來監(jiān)測發(fā)酵情況[24]。由圖2b可知，在0 h時(shí)，對照組與蛋白質(zhì)底物添加組發(fā)酵液中pH組間差異不顯著（P＞0.05)。在24 h時(shí)，蛋白質(zhì)底物添加組pH顯著低于對照組（P＜0.05)，其中大豆蛋白組顯著低于酪蛋白組和豌豆蛋白組（P＜0.05)，酪蛋白與豌豆蛋白組間差異不顯著，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸的緣故，且說明大豆蛋白產(chǎn)生了更高濃度的短鏈脂肪酸。至48 h時(shí)，蛋白質(zhì)底物添加組pH上升至對照組水平，組間無顯著差異（P＞0.05)，這提示，蛋白質(zhì)的添加顯著影響微生物發(fā)酵，進(jìn)而降低pH，影響腸道內(nèi)環(huán)境，但是隨著時(shí)間延長，發(fā)酵體系趨于穩(wěn)態(tài)，繼而穩(wěn)定環(huán)境，使pH恢復(fù)至正常水平。

圖2 體外發(fā)酵中各時(shí)間點(diǎn)pH變化Fig.2 Changes of pH at each time point during in vitro fermentation

2.3 不同來源蛋白質(zhì)對人體糞便微生物發(fā)酵液中NH3-N濃度的影響

氨態(tài)氮是微生物生長的重要氮源，其濃度在一定程度上可以反映出發(fā)酵液中蛋白質(zhì)降解與合成之間的平衡狀態(tài)[25]。由圖3a可知，對照組在發(fā)酵期間NH3-N濃度基本保持不變，蛋白質(zhì)底物添加組的發(fā)酵液中NH3-N濃度整體呈現(xiàn)增加的趨勢，在 24 h顯著高于 0 h （P＜0.05），48 h顯著高于24 h（P＜0.05），這說明隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)降解的速度高于微生物合成自身蛋白的速度。葛婷等[26]報(bào)道稱蛋白添加組隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，氨態(tài)氮濃度逐漸上升，本試驗(yàn)結(jié)果與其觀點(diǎn)一致。由圖3b可知，在0 h時(shí)，對照組與蛋白質(zhì)底物添加組發(fā)酵液中NH3-N濃度組間差異不顯著。在24 h時(shí)，蛋白質(zhì)底物添加組發(fā)酵液中NH3-N濃度顯著高于對照組 （P＜0.05），其中大豆蛋白組顯著高于酪蛋白組和豌豆蛋白組（P＜0.05），酪蛋白與豌豆蛋白組間差異不顯著（P＞0.05）。至48 h時(shí)，蛋白質(zhì)底物添加組NH3-N濃度繼續(xù)升高，大豆蛋白組顯著高于酪蛋白組和豌豆蛋白組 （P＜0.05），且豌豆蛋白組顯著高于酪蛋白組（P＜0.05）。牟曉玲等[27]報(bào)道稱大豆黃酮能夠提高培養(yǎng)液中氨態(tài)氮濃度，從而提高粗飼料蛋白質(zhì)在瘤胃液中的降解速度，對于蛋白質(zhì)在瘤胃中的消化和吸收是有益的。本試驗(yàn)結(jié)果說明大豆蛋白和豌豆蛋白能夠產(chǎn)生更高濃度的NH3-N，更有利于蛋白質(zhì)的消化和吸收。

2.4 不同來源蛋白質(zhì)對人體糞便微生物發(fā)酵液中MCP濃度的影響

MCP濃度反映著微生物利用底物為自身合成蛋白質(zhì)的需要。由圖4a可知，對照組在發(fā)酵期間，MCP濃度略有升高，蛋白質(zhì)底物添加組的發(fā)酵液中MCP濃度整體呈現(xiàn)上升的趨勢，在24 h顯著高于 0 h （P＜0.05），48 h 顯著高于 24 h （P＜0.05）。Dehority等[28]指出，日飼1次的綿羊和牛犢在飼喂后1～4 h內(nèi)，MCP濃度呈下降趨勢，隨后逐漸上升，在12～20 h內(nèi)MCP濃度達(dá)最高值，隨后下降直至下一次飼喂，與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能是研究手段和采樣時(shí)間點(diǎn)不同造成的差別，原因有待進(jìn)一步探討。由圖4b可見，在0 h時(shí)，對照組與蛋白質(zhì)底物添加組發(fā)酵液中MCP濃度組間差異不顯著。在后期的整個(gè)發(fā)酵期間，蛋白質(zhì)底物添加組MCP濃度顯著高于對照組（P＜0.05），其中大豆蛋白和豌豆蛋白組顯著高于酪蛋白組（P＜0.05）。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液中的MCP濃度顯著增加，且大豆蛋白和豌豆蛋白組顯著高于酪蛋白組，這可能預(yù)示著，添加大豆蛋白和豌豆蛋白后更有利于提高微生物利用氨基酸合成自身所需蛋白質(zhì)的能力。此外，NH3-N是蛋白質(zhì)降解和微生物合成MCP的中間產(chǎn)物[25]，由于大豆蛋白和豌豆蛋白高的NH3-N濃度，導(dǎo)致產(chǎn)生更高濃度的MCP。

圖3 體外發(fā)酵期間氨態(tài)氮濃度變化Fig.3 Changes of NH3-N concentration during in vitro fermentation

圖4 體外發(fā)酵期間MCP濃度變化Fig.4 Changes of MCP concentration during in vitro fermentation

2.5 不同來源蛋白質(zhì)對人體糞便微生物發(fā)酵液中VFA濃度的影響

微生物利用宿主未消化吸收的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生VFA，其中微生物利用碳水化合物及蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物生成SCFA，會為人體提供約10%的熱量[29]。張逢生等[30]報(bào)道稱乙酸具有促進(jìn)胃液分泌，幫助消化，降血脂，降低膽固醇，擴(kuò)張血管，延緩血管硬化等功能；丙酸作為肝臟代謝的能源并能夠抑制膽固醇的合成[31]；丁酸被認(rèn)為是結(jié)腸細(xì)胞所需的最重要的能量來源，有助于結(jié)腸細(xì)胞的分化及增殖等[32-34]。由圖5a、c、e、g 可見，發(fā)酵期間，對照組和蛋白質(zhì)底物添加組的SCFA濃度都有不同程度的增加，但蛋白質(zhì)底物添加組增加的更多。SCFA濃度在 24 h顯著高于 0 h （P＜0.05），48 h時(shí)持續(xù)增加。由圖5b、d、f、g可見，不同來源蛋白質(zhì)對人體糞便發(fā)酵液中短鏈脂肪酸濃度有一定的影響。乙酸、丙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸在0 h時(shí)，對照組與蛋白質(zhì)底物添加組組間差異不顯著（P＞0.05）。在24 h時(shí)，蛋白質(zhì)底物添加組顯著高于對照組（P＜0.05）。其中，總短鏈脂肪酸、乙酸：整個(gè)發(fā)酵期間，大豆蛋白組顯著高于酪蛋白和豌豆蛋白組（P＜0.05），48 h時(shí)，酪蛋白組與豌豆蛋白組差異不顯著（P＞0.05）；丙酸：24 h時(shí)，大豆蛋白組顯著高于酪蛋白組和豌豆蛋白組（P＜0.05）；丁酸：24 h 時(shí)，大豆蛋白組顯著高于酪蛋白組和豌豆蛋白組（P＜0.05），48 h時(shí)，三組之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。說明大豆蛋白經(jīng)體外發(fā)酵24 h時(shí)，產(chǎn)生了更高濃度的SCFA，為人體提供能量，有利于腸道益生菌的增殖，從而有益腸道健康。

圖5 體外發(fā)酵期間各時(shí)間點(diǎn)SCFA濃度變化Fig.5 Changes of SCFA concentration at each time point during in vitro fermentation

與SCFA相比，BCFA僅僅是由支鏈氨基酸所發(fā)酵產(chǎn)生的，例如，異丁酸、異戊酸，分別是由纈氨酸、亮氨酸發(fā)酵產(chǎn)生[35]，所以BCFA可以作為微生物利用蛋白質(zhì)的標(biāo)記[36]。圖6a、c、e比較可見，發(fā)酵期間，對照組和蛋白質(zhì)底物添加組的BCFA濃度都有不同程度的增加。其中，對照組的BCFA濃度增加，說明糞便中還殘留有部分未消化的蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)底物添加組的BCFA濃度增加，說明微生物在不斷的利用蛋白質(zhì)產(chǎn)生BCFA。沈冰蕾等[37]報(bào)道稱支鏈脂肪酸是瘤胃微生物生長、繁衍的必需物質(zhì)，可促進(jìn)瘤胃纖維素分解菌的生長和微生物蛋白的合成。圖6b、d、f比較可見，3種蛋白質(zhì)對人體糞便發(fā)酵液中支鏈脂肪酸濃度均有一定的影響。在整個(gè)發(fā)酵期間，大豆蛋白和豌豆蛋白組顯著高于酪蛋白組（P＜0.05），說明大豆蛋白和豌豆蛋白產(chǎn)生的高濃度的MCP可能是因?yàn)榇x產(chǎn)物異丁酸和異戊酸的產(chǎn)生。

圖6 體外發(fā)酵期間各時(shí)間點(diǎn)BCFA濃度變化Fig.6 Changes of BCFA concentration at each time point during in vitro fermentation

3 結(jié)論

在體外發(fā)酵體系中，蛋白質(zhì)的添加提高了MCP的合成能力，并且大豆蛋白發(fā)酵液中高濃度的NH3-N和BCFA以及豌豆蛋白發(fā)酵液中高濃度的BCFA，使得其合成了更高濃度的MCP。

在體外發(fā)酵體系中，蛋白質(zhì)的添加降低了pH，提高了SCFA濃度，并且大豆蛋白產(chǎn)生了更高濃度的SCFA，說明氮源不同的發(fā)酵底物影響SCFA的類型和數(shù)量，且由于不同的SCFA有各自特定的生理作用，可能會導(dǎo)致不同的代謝結(jié)果。

綜上所述，大豆蛋白和豌豆蛋白有很好的發(fā)酵效果，其降低pH值、提高VFA產(chǎn)量、提高M(jìn)CP濃度均顯著優(yōu)于酪蛋白，更有利于腸道健康。