多香果對(duì)生鮮肉制品中N-亞硝胺、生物胺及游離氨基酸含量的影響

朱倩穎 王宗義 丁 軻 陳湘寧 韓 濤*

（1 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 北京 102206

2 中國(guó)地質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)院 北京 100081）

N-亞硝胺是公認(rèn)的致突變、致畸和致癌的有毒物質(zhì)[3]。N-亞硝胺常存在于腌制肉制品中。生鮮肉制品和方便調(diào)理制品是家庭烹飪中重要的肉制品原材料之一，可通過多種烹飪方法，如蒸、煮、炸、烤、燉等，制作成菜肴、獅子頭等精美食物，因方便快捷而深受大眾喜愛。以生鮮肉丸為例，其以純?nèi)鉃橹饕?，通過加入調(diào)味料及硝酸鹽來顯色、增香，后者可使蛋白質(zhì)產(chǎn)生的胺類與硝酸鹽反應(yīng)生成N-亞硝胺[1-2]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)N-亞硝胺形成的抑制做了一些研究。吳春等[4]通過提取葡萄籽中的花青素，將花青素在模擬胃液條件下加入二甲胺和亞硝酸鈉，抑制N-亞硝胺形成，可能是花青素優(yōu)先與亞硝酸鹽反應(yīng)，減少N-亞硝胺形成的前體物質(zhì)亞硝酸鹽的濃度?；ㄇ嗨貙儆诙喾宇愇镔|(zhì)，廣泛存在于植物中，具有抗氧化、抗炎、抑菌的作用[5]。國(guó)內(nèi)外大多研究是添加少量的天然材料，以期減少N-亞硝胺形成，然而存在抑制率低，抑制原理不清等問題。研究生鮮或腌制肉制品中N-亞硝胺的天然抑制劑及探究其抑制原理具有重要意義。

多香果（Pimenta officinalis L.）是含有多酚類物質(zhì)的香辛料，別名牙買加胡椒、三香子甘椒，主產(chǎn)地牙買加、古巴等中南美洲國(guó)家，被稱為天然抗氧化劑，其主要成分為丁子香酚（Eugenol），具有強(qiáng)烈芳香味，磨成粉末可用于多種烹飪食品的添香、加味，同時(shí)還具有抑菌、消毒、防蟲、抗氧化等作用[6]。多香果的安全使用量是670 mg/kg，可作為天然抗氧化劑用于肉制品[7]。目前有關(guān)多香果在生鮮或腌制肉制品中對(duì)N-亞硝胺形成的影響研究還很欠缺。

本文以肉丸為生鮮肉制品的代表，通過添加不同濃度的多香果，探討多香果對(duì)肉丸中N-亞硝胺、生物胺含量的影響，并探討多香果對(duì)N-亞硝胺生成的影響及與游離氨基酸和生物胺的關(guān)系，為提高肉制品的安全性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑及儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料 多香果（牙買加進(jìn)口），淘寶店“老三鋪?zhàn)印?；原料肉（豬肉），回龍觀龍華園美廉美超市；食鹽，中鹽北京市鹽業(yè)有限公司；食糖，北京糖業(yè)煙酒有限公司；白酒（52°），北京紅星二鍋頭酒廠；亞硝酸鈉，北京化工廠；味精，上海太太樂食品有限公司；黑胡椒、生姜粉，北京吉得利食品有限公司。

1.1.2 主要試劑 二氯甲烷、甲醇、乙腈、丙酮（色譜純），韓國(guó)德山藥品工業(yè)；NDPA-d14、NDMA、NPIP、NPYR、NMEA、NDPA、NMOR、NDBA、NDEA（1 000 μg/mL，1mL）標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó) o2si公司；NDMA-d6 （1 000 μg/mL，1 mL），美國(guó) Accustandard Inc公司；Sep-Pak AC2固相萃取小柱，美國(guó)Waters公司；色胺、腐胺、苯乙胺、尸胺、酪胺、組胺、亞精胺、精胺，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氫氧化鋇、磺基水楊酸、高氯酸、碳酸氫鈉、丹磺酰氯、氨水，北京化工廠；0.22 μm有機(jī)系一次性微孔濾頭，北京八方科技有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 7890B 7000GC-MS/MS，美國(guó)Agilent公司；BF2000氮?dú)獯蹈蓛x，北京八方世紀(jì)科技有限公司；PE20 pH計(jì)，梅特勒-托列多（上海）儀器有限公司；H-20R型離心機(jī)，北京安必升科技發(fā)展有限公司；HH-2恒溫水浴鍋，金壇市岸頭國(guó)瑞實(shí)驗(yàn)儀器廠；DHP-500恒溫培養(yǎng)箱，上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HDP-25A型固相萃取裝置，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；FSH-2可調(diào)高速勻漿機(jī)，常洲國(guó)華電器有限公司；S-433D全自動(dòng)氨基酸分析儀，德國(guó)賽卡姆公司；HPLC1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 肉制品配方 原料肉（臀尖肉）以1 kg為基礎(chǔ)的配方：鹽 0.03 kg，糖 0.04 kg，酒 0.025 kg，硝酸鈉 0.5×10-3kg，味精 0.003 kg，黑胡椒 0.002 kg，生姜粉 0.003 kg，多香果[8]。

1.2.2 肉丸工藝流程 原料肉→斬拌→調(diào)配→制作（直徑約5 cm的肉丸）→冷藏（4℃）[8]。

將新鮮原料肉用絞肉機(jī)絞碎，使肥瘦均勻，按照1.2.1節(jié)中的材料和配比混合于原料肉中，制成5 cm左右肉丸，用保鮮膜包好，放入4℃冰箱中冷藏9 d。

1.2.3 N-亞硝胺的測(cè)定 參考夏曉楠等[9-10]的方法。測(cè)定得到二甲基亞硝胺（NDMA）、亞硝基吡咯烷（NPYR）、亞硝基哌啶（NPIP）的含量。

1.2.4 生物胺的測(cè)定 根據(jù)樊曉盼等[11]的方法略有改動(dòng)，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配置：準(zhǔn)確稱取酪胺（Tyr）、尸 胺 （Cad）、組 胺 （His）、色 胺 （Try）、對(duì)苯 乙 胺（Phe）、腐胺（Put）、精胺（Spm）、亞精胺（Spd）標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，用高氯酸（0.4 mol/L）定容于棕色容量瓶中（50 mL），配制成1 mg/mL儲(chǔ)備液備用。分別取上述儲(chǔ)配液，用上述濃度的高氯酸配制成質(zhì)量濃度分別為 1.0，5.0，10，20，100 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃黑暗保存。

樣品液配制：準(zhǔn)確稱取5 g左右絞碎肉丸樣品于研缽中，加入20 mL上述高氯酸，研磨。離心（4℃，2 500 r/min，10 min），重復(fù)提取。上清液用高氯酸定容至50 mL。

衍生化：分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液1 mL，加入 2 mol/L 的NaOH 200 μL，飽和 NaHCO3300 μL，再加入10 mg/mL的丹磺酰氯-丙酮溶液，置于4℃水浴黑暗反應(yīng)30 min，加入100 μL氨水終止反應(yīng)。用乙腈定容至5 mL，以 4℃，2 500 r/min離心3 min，經(jīng)0.22 μm的有機(jī)過濾膜過濾，上機(jī)待測(cè)。

色譜條件：色譜柱：2.1 mm，DAD檢測(cè)器：波長(zhǎng)254 nm，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL，柱溫：30℃，流動(dòng)相A：超純水，流動(dòng)相B：乙腈。梯度洗脫，洗脫條件見表1。

表1 HPLC流動(dòng)相洗脫梯度Table1 HPLC mobile phase elution gradient

1.2.5 游離氨基酸的測(cè)定 根據(jù)苗雨田等[12]的方法略有改動(dòng)，樣品制備：取絞碎的肉丸，經(jīng)組織粉碎機(jī)粉碎，攪拌均勻，稱取3 g樣品，加入30 mL 8%的磺基水楊酸，高速均質(zhì)，離心20 min（4℃，10 000 r/min），取上清液重復(fù)離心，過濾。加5 mL正己烷，10 mL甲醇，充分振蕩。用2 mol/L的NaOH和2 mol/L的HCl調(diào)pH值至2.2，加水定容至50 mL，過0.22 μm濾膜，取過濾后的上清液測(cè)定。全自動(dòng)氨基酸分析儀法，Li+型離子交換柱：4.6 mm×60 mm；茚三酮流速：0.35 mL/min；緩沖液流速：0.4 mL/min；柱溫：57℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：λ1=570 nm，λ2=440 nm；標(biāo)準(zhǔn)氨基酸樣品：10 nmol/L；進(jìn)樣量：20 nL；129 min上機(jī)定量分析。

表2 氨基酸全自動(dòng)分析儀洗脫梯度Table2 Amino acid automatic analyzer elution gradient

2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

肉丸制作過程中，依據(jù)以上配方，分為4組，每組除多香果含量外，其余成分完全相同。第1組為對(duì)照組，不添加多香果；第2組至第4組分別添加0.02%，0.04%，0.08%的多香果。4℃冷藏9 d，每隔1 d測(cè)定指標(biāo)1次，包括各N-亞硝胺、生物胺和游離氨基酸，每個(gè)指標(biāo)每組樣品設(shè)置3個(gè)平行。抑制率按下式計(jì)算[13]：

式中，M0——空白組；N-亞硝胺含量；Mt——試驗(yàn)組；N-亞硝胺含量。

3 數(shù)據(jù)處理與相關(guān)性分析

使用Microsoft Excel 2013，計(jì)算平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)偏差、抑制率并作圖。統(tǒng)計(jì)和相關(guān)性分析用SAS 9.0軟件（SAS公司）進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平和極顯著性差異水平分別為0.05和0.01。

4 結(jié)果與討論

4.1 多香果肉丸中N-亞硝胺含量的變化影響

肉丸中3個(gè)N-亞硝胺的含量在貯藏期間呈波動(dòng)性變化（圖1），空白組NDMA的含量呈先上升后下降的趨勢(shì)；NPYR的含量在第9天最高；NPIP含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降。與空白組相比，不同濃度多香果均可降低肉丸中3個(gè)N-亞硝胺的含量，NDMA的含量在1～7 d內(nèi)波動(dòng)較大，NPYR的含量在第9天最高，NPIP的含量在3～5 d內(nèi)波動(dòng)不大，其中多香果濃度對(duì)NDMA含量的影響顯著 （P＜0.05），NDMA隨多香果濃度的升高而降低，多香果濃度對(duì)NPIP、NPYR的影響不顯著（P＞0.05）。添加 0.08%的多香果，對(duì)3個(gè) N-亞硝胺抑制率最高分別為53.29%，86.38%，68.59%，因此，在安全使用范圍之內(nèi)，濃度越高抑制效果可能越好。

4.2 多香果對(duì)肉丸中生物胺含量變化的影響

根據(jù)圖2 HPLC生物胺混標(biāo)色譜圖的出峰時(shí)間對(duì)肉丸中8個(gè)生物胺進(jìn)行定性分析，根據(jù)表3不同生物胺的線性試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)8個(gè)生物胺進(jìn)行了定量。

肉丸中生物胺的含量在貯藏期間呈波動(dòng)性變化（圖3）。與空白組相比，不同濃度多香果降低了肉丸中5個(gè)生物胺的含量。添加香辛料可有效抑制肉丸中的生物胺，這與孫欽秀等[14]的研究類似。如圖3（a）所示，多香果濃度對(duì)Try影響不穩(wěn)定，在第1，3，9天添加多香果組比空白組中的Try含量顯著降低，最大減少率為62.79%，總體上多香果的添加減少了Try的生成。如圖3（b）所示，多香果對(duì)Phe的影響顯著（P＜0.05），貯藏 3～9 d，Phe 含量隨多香果濃度的升高而降低，7 d后極顯著 （P＜0.01）；空白組第 3，5，7，9 天比第 1 天 Phe 含量分別增加了 47.77，21.25，92.24，69.86 μg/g，且多香果濃度越高，Phe生成量越低，這有可能與生成苯乙胺的前體物質(zhì)苯丙氨酸有關(guān)。如圖3（c）所示，空白組的Put含量呈上升趨勢(shì)，多香果組Put隨多香果濃度的升高而降低（P＜0.05），有明顯規(guī)律；如圖3（d）所示，空白組在貯藏期間Spd呈不規(guī)律變化，但多香果對(duì)其影響總體上具有顯著性（P＜0.05），Spd隨多香果濃度的升高而降低，基本上是極顯著（P＜0.01）。如圖3（e）所示，空白組的Spm變化不規(guī)律，總體平穩(wěn)，多香果對(duì)其影響不穩(wěn)定,說明添加多香果對(duì)Spm有減少的作用，這可能與產(chǎn)生精胺的前體物質(zhì)精氨酸有關(guān)。

圖1 不同多香果添加量肉丸N-亞硝胺含量的變化Fig.1 Changes of N-nitrosamines in different concentrations of allspice

圖2 HPLC生物胺混標(biāo)色譜圖Fig.2 The HPLC chromatogram for a standards mixture of biogenic amines

表3 不同生物胺的線性試驗(yàn)結(jié)果Table3 Linear test results for different biogenic amines

圖3 添加不同濃度多香果后生物胺含量的變化Fig.3 The changes of biogenic amines in different concentrations of allspice powder

4.3 肉丸中生物胺和N-亞硝胺的相關(guān)性

表4為空白組生物胺和添加多香果組生物胺與N-亞硝胺的相關(guān)性，空白組的Phe與NPIP具有顯著相關(guān)性（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為 0.5680；添加多香果組的Phe與NPIP相關(guān)性上升且相關(guān)系數(shù)為 0.6652（P＜0.05），Phe與 NPYR 具有顯著負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為-0.6759 （P＜0.01），Spm 與 NDMA相關(guān)性上升且具有顯著性（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.4829。空白組與添加多香果組肉丸中生物胺和N-亞硝胺相關(guān)性發(fā)生了改變。Phe與NPYR和NPIP、Spm與NDMA相關(guān)性上升，說明多香果影響了Phe與NPYR、Spm與NDMA之間的關(guān)系。原因可能是多香果的添加改變了N-亞硝胺或生物胺產(chǎn)生的途徑，需進(jìn)一步研究。

表4 未添加多香果與添加多香果肉丸中生物胺和N-亞硝胺的相關(guān)性Table4 The correlation between N-nitrosamines and biogenic amines in meatballs with or without adding allspice

4.4 添加不同濃度多香果的肉丸中游離氨基酸含量的比較

如表5所示，不同濃度多香果對(duì)18種游離氨基酸含量的影響，空白組天冬氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸第3，5，7，9天均比第1天含量低，而添加多香果組各氨基酸在3，5，7，9天比第1天的含量高。貯藏過程中，肉制品中的生物胺是N-亞硝胺形成的前體物質(zhì)之一[15]，肉丸中的微生物產(chǎn)生催化氨基酸脫羧的脫羧酶，促進(jìn)生物胺的生成[16]，說明在肉丸中某些游離氨基酸有可能轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的生物胺，為N-亞硝胺的生成創(chuàng)造了前體物質(zhì)。

由圖3和表5可知，游離氨基酸含量減少，生物胺含量升高，表明游離氨基酸部分生成了生物胺；其中苯丙氨酸是形成Phe的前體物質(zhì)，空白組苯乙胺含量升高，苯丙氨酸含量降低，加入多香果組苯丙氨酸含量比第1天升高，說明多香果抑制了苯丙氨酸形成Phe；精氨酸是形成Spm的前體物質(zhì)，空白組精胺含量升高，精氨酸含量降低，可能是精氨酸形成了精胺；而且在貯藏期間加入多香果組Spm含量減少，而精氨酸含量升高，說明多香果抑制了Spm的生成。

肉制品中的胺類物質(zhì)主要是由酶和細(xì)菌分解肉中的蛋白質(zhì)、糖、脂肪生成的[17-18]。邢必亮等[19]研究認(rèn)為生物胺總含量與微生物代謝密切相關(guān)，并提出生物胺的減少可有效減少N-亞硝胺的生成。在食品中亞精胺和腐胺與亞硝酸鹽生成NDMA，亞精胺和尸胺與亞硝酸鹽反應(yīng)生成NPIP[20]。脯氨酸含量與NPYR的生成有關(guān)[21]。肉制品中主要成分是蛋白質(zhì)，在微生物作用下蛋白質(zhì)能分解出大量的游離氨基酸[22]。大量生物胺對(duì)人體有害，腌制肉制品中含有豐富的蛋白質(zhì)和大量亞硝酸鹽，會(huì)生成N-亞硝胺[23]。常見的幾種生物胺有Tyr、Spm、Spd、Cad、Put、Phe、Try、His[24]。Kim等[25]對(duì)意大利辣香腸進(jìn)行了輻照，檢測(cè)其中生物胺和pH值水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過輻照的樣品乳酸菌的增長(zhǎng)有所下降，阻止了pH值的下降；γ射線可有效減少6種生物胺（Tyr、Spm、Spd、Cad、Put、Phe）的生成，同時(shí)與 pH值的下降緩慢有一定相關(guān)性，從而減小N-亞硝胺的生成。盧士玲等[26]篩選了能產(chǎn)生生物胺氧化酶的微生物，可耐糖、鹽和亞硝酸鹽，分離到3株產(chǎn)生物胺氧化酶菌，符合肉品發(fā)酵劑標(biāo)準(zhǔn)且生長(zhǎng)能力強(qiáng)、產(chǎn)酸能力差、可抑制產(chǎn)生物胺優(yōu)勢(shì)菌的作用，可通過減少生物胺的含量來減少N-亞硝胺的生成。本研究選擇多香果用于肉丸的調(diào)味，既不會(huì)影響亞硝酸鹽的作用，又能減少N-亞硝胺的生成。

生物胺和游離氨基酸與肉制品的表面紅度有關(guān)，原因可能與含氮化合物對(duì)基質(zhì)環(huán)境酸堿度的變化有關(guān)[27]。蛋白質(zhì)的降解提高了肽和游離氨基酸的含量，提供了胺類產(chǎn)生的前體物質(zhì)[28]。生物胺是一種含氮化合物，具有生物活性。根據(jù)食品中生物胺來源的不同，將其合成途徑分為兩種：其一是內(nèi)源性生物胺，屬于脂肪族的生物胺，是由發(fā)酵或酮的轉(zhuǎn)氨作用生成；其二是由游離氨基酸脫羧產(chǎn)生的胺，即在微生物的氨基酸脫羧酶作用下蛋白質(zhì)分解出的游離氨基酸脫羧生成的生物胺。一般來說，肉制品中的生物胺大多是由具有氨基酸脫羧酶作用的微生物使氨基酸脫去羧基而生成[29]。多香果減少生物胺的含量可能是其減少了氨基酸到生物胺的合成幾率。

表5 不同濃度多香果對(duì)肉丸中18種游離氨基酸含量的影響（μg/g）Table5 Effects of different concentrations of allspice on 18 free amino acids in meatballs （μg/g）

（續(xù)表5）

5 結(jié)論

多香果對(duì)冷鮮肉制品中NDMA、NPIP、NPYR含量總體上具有顯著的影響，隨多香果添加濃度的升高而含量降低，添加0.04%和0.08%多香果的抑制效果較好。多香果對(duì)Phe、Put、Spd總體上也具顯著抑制效果；空白組苯丙氨酸含量降低，添加多香果組含量升高。未添加多香果空白組與添加多香果組生物胺和N-亞硝胺相關(guān)性發(fā)生了改變，Phe與NPIP和NPYR相關(guān)性上升，Spd與NDMA的相關(guān)性上升。