陳玉樂(lè)，楊文杰，呂 偉，劉天杰，李 磊

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061)

膀胱癌是人體泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一[1]。腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，AM)是降鈣素基因肽超家族成員，參與了心血管疾病、炎癥和腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。受體活性調(diào)節(jié)蛋白(receptor activity modifying protein，RAMP)2和RAMP3在AM與其受體的結(jié)合中具有決定性的調(diào)控作用，是AM介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)及生物學(xué)功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子[2]。體外研究表明，AM可抑制膀胱癌細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲及遷移[3-4]。然而，AM及其下游信號(hào)關(guān)鍵蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)尚不明確。在本研究中，我們擬通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法探討AM、RAMP2、RAMP3在膀胱癌中的表達(dá)和意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料AM和RAMP3抗體購(gòu)自Abcam公司(Cambridge，UK)。RAMP2抗體購(gòu)自Santa Cruz 公司(CA，USA)。EnVision免疫組織化學(xué)染色試劑盒購(gòu)自DAKO 公司(CA，USA)。

1.2 膀胱癌組織標(biāo)本人膀胱癌組織芯片購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司(貨號(hào)：HBla-Uro105Sur-01)，包含59例膀胱移行細(xì)胞癌和46例癌旁尿路上皮組織。3張組織芯片分別用于AM、RAMP2、RAMP3的免疫組織化學(xué)染色。無(wú)尿路上皮組織或癌組織、染色過(guò)程中脫片或因有效組織太小影響結(jié)果判定者均被排除。11例標(biāo)本因缺乏患者生存信息而被排除于生存分析之外。最終25例尿路上皮組織和58例膀胱癌組織被用于蛋白表達(dá)分析，47例膀胱癌組織被用于生存分析。本研究所采用的膀胱癌標(biāo)本的臨床和病理信息見(jiàn)表1。

表1 58例膀胱癌臨床病理資料

項(xiàng)目例數(shù)(%)中位年齡(歲)68.4(44～85)臨床分期 Tis5(5.9) T111(19.0) T217(29.3) T322(37.9) T43(5.2)項(xiàng)目例數(shù)(%)性別 男49(84.5) 女9(15.5)病理分級(jí) G13(5.2) G232(55.2) G323(39.7)中位隨訪時(shí)間(月)34.1(3～82)

1.3 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果評(píng)估采用DAKO EnVisionTM +系統(tǒng)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。組織芯片經(jīng)脫蠟、水化等處理后浸入檸檬酸緩沖液，于121 ℃抗原修復(fù)5 min。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷15 min后滴加一抗(1∶150稀釋)，4 ℃孵育12 h，隨后用EnVision-HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，并依次進(jìn)行DAB顯色、蘇木素染色、鹽酸分化、氨水返藍(lán)等處理。梯度酒精溶液脫水和二甲苯透明后以中性樹(shù)膠封片。染色結(jié)果評(píng)估按本實(shí)驗(yàn)室常用的綜合染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的雙重評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行。由1位病理科醫(yī)師在不知實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c患者信息的情況下進(jìn)行，每例組織在高倍鏡下隨機(jī)挑取5個(gè)高倍視野進(jìn)行評(píng)分。根據(jù)染色強(qiáng)度將結(jié)果分為無(wú)著色、弱著色、中等著色及強(qiáng)著色4類，分別得0、1、2、3分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比將結(jié)果分為-、<25%、25%～≤50%、>50%～≤75%、>75%共5類，分別得0、1、2、3、4分。將上述2種方法得分相乘得到介于0～12分之間的總得分，將總得分≥4分的組織定義為表達(dá)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Pearson卡方檢驗(yàn)(T>5)或Yates’連續(xù)性校正卡方檢驗(yàn)(T≤5)進(jìn)行不同組別間蛋白表達(dá)差異分析，采用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析。P<0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AM在膀胱癌組織中的表達(dá)通過(guò)對(duì)25例癌旁尿路上皮組織和58例膀胱移行細(xì)胞癌組織的免疫組織化學(xué)染色，觀察到AM主要定位于尿路上皮細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖1A，紅色箭頭)。根據(jù)我們的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，11例(44%)尿路上皮組織和23例(39.6%)膀胱癌組織被鑒定為AM陽(yáng)性。統(tǒng)計(jì)分析顯示癌旁尿路上皮組織和膀胱癌組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。AM表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤分期、分級(jí)無(wú)關(guān)(表2)。生存分析顯示AM+組和AM-組患者總生存期無(wú)明顯差異(HR:0.68，95%CI:0.32～1.47，P=0.34，圖1B)。此外，間質(zhì)細(xì)胞中也有AM表達(dá)(圖1A，藍(lán)色箭頭)，表明間質(zhì)細(xì)胞也是腫瘤微環(huán)境中AM的重要來(lái)源。

圖1 AM在膀胱癌和癌旁尿路上皮組織中的表達(dá)

A：AM在膀胱癌和癌旁尿路上皮組織中的表達(dá)(紅色、藍(lán)色箭頭分別示腫瘤和間質(zhì)細(xì)胞中的AM表達(dá))；B：AM+和AM-組患者總生存期比較。

2.2 RAMP2在膀胱癌組織中的表達(dá)隨后我們進(jìn)行了RAMP2的免疫組織化學(xué)染色(圖2A)。7例(28%)尿路上皮組織和32例(55.2%)膀胱癌組織被鑒定為RAMP2陽(yáng)性。統(tǒng)計(jì)分析表明，兩組間RAMP2表達(dá)具有顯著性差異(P<0.05)。通過(guò)對(duì)不同分級(jí)腫瘤的比較發(fā)現(xiàn)，3級(jí)膀胱癌具有比1～2級(jí)膀胱癌更高的RAMP2表達(dá)水平的趨勢(shì)(60.9%vs.51.4%)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2，P>0.05)。此外，年齡<70歲的患者的RAMP2表達(dá)水平高于≥70歲的患者(表2，P<0.05)。不同性別、腫瘤分期患者RAMP2表達(dá)無(wú)明顯差異(表2)。與RAMP2-的患者相比，RAMP2+的患者具有更短的總生存期(HR:2.73；95%CI:1.30～5.80；P<0.01，圖2B)。

2.3 RAMP3在膀胱癌組織中的表達(dá)針對(duì)RAMP3的免疫組織化學(xué)染色(圖2A)發(fā)現(xiàn)，19例(76%)尿路上皮組織和48例(82.8%)膀胱癌組織被鑒定為RAPM3陽(yáng)性。統(tǒng)計(jì)分析表明癌旁尿路上皮組織與膀胱癌組之間RAMP3表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。RAMP3表達(dá)與患者年齡、性別及腫瘤分期、分級(jí)無(wú)關(guān)(表2)。此外，RAMP3-患者與RAMP3+患者的總生存期也無(wú)明顯差異(HR:1.36；95%CI:0.51～3.45；P>0.05，圖2C)。

圖2 RAMPs在膀胱癌和癌旁尿路上皮組織中的表達(dá)

A:RAMP2和RAMP3的表達(dá)代表圖；B:RAMP2+和RAMP2-組患者總生存期比較；C.RAMP3+和RAMP3-組患者總生存期比較。

表2 AM、RAMP2和RAMP3在膀胱癌的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

3 討 論

AM是一種具有舒張血管、降低血壓等多重活性的分泌性蛋白，因最初是從人腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤中分離出來(lái)而得名[5]。腫瘤微環(huán)境中AM的來(lái)源及調(diào)控復(fù)雜多變。一方面，腫瘤細(xì)胞在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可獲得較高的AM表達(dá)水平[6]；另一方面，多種間質(zhì)細(xì)胞成分如血管內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等均可產(chǎn)生AM[7]。此外，缺氧等條件也進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)AM[8]。AM介導(dǎo)的bcl-2上調(diào)對(duì)于缺氧條件下骨肉瘤細(xì)胞的存活至關(guān)重要[9]。我們最近的研究表明，腎癌細(xì)胞產(chǎn)生的AM可通過(guò)肥大細(xì)胞促進(jìn)血管形成[10]。有學(xué)者通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)及Western blot實(shí)驗(yàn)初步檢測(cè)了AM在人膀胱癌及癌旁正常組織的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AM在膀胱癌的表達(dá)高于癌旁組織，并與腫瘤分期正相關(guān)。在體外培養(yǎng)的膀胱癌細(xì)胞系，AM可被缺氧條件誘導(dǎo)表達(dá)，沉默AM表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤生長(zhǎng)[4]。另一項(xiàng)研究表明，AM可促進(jìn)膀胱癌和前列腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[3]。本研究中，我們通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)了AM在膀胱癌及癌旁尿路上皮組織的表達(dá)，相對(duì)于實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)及Western blot，免疫組織化學(xué)染色可更直觀地檢測(cè)蛋白在組織及細(xì)胞的定位情況。與前人研究不同的是，我們并未發(fā)現(xiàn)AM在膀胱癌和尿路上皮組織之間的表達(dá)差異，亦未觀察到AM與腫瘤分期有關(guān)。我們?cè)诎螂装┘?xì)胞及膀胱癌間質(zhì)細(xì)胞中均觀察到AM表達(dá)，表明膀胱癌組織中AM來(lái)源的復(fù)雜性，也提示AM可能是膀胱癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞之間“對(duì)話”的重要介質(zhì)。

降鈣素受體樣受體(calcitonin-receptor-like receptor，CRLR)隸屬G蛋白偶聯(lián)受體，是AM的主要受體[7]。CRLR與AM的結(jié)合受RAMPs調(diào)控。當(dāng)CRLR與RAMP1結(jié)合時(shí)，形成降鈣素受體而與降鈣素結(jié)合。當(dāng)CRLR與RAMP2或RAMP3結(jié)合時(shí)，形成AM受體，與AM結(jié)合并介導(dǎo)其生物學(xué)功能。因此，RAMPs可決定AM與CRLR的親和力，是AM下游信號(hào)的重要調(diào)節(jié)蛋白[2]。研究表明，AM可通過(guò)CRLR/RAMP2、CRLR/RAMP3實(shí)現(xiàn)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、分化和凋亡的調(diào)控。

然而，RAMP2與RAMP3的功能并不完全相同。CRLR/RAMP2只能被AM激活，而CRLR/RAMP3對(duì)AM和intermedin(也稱為AM2)具有相同的親和力，因而可以被這兩種配體激活[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示AM或RAMP2敲除小鼠由于血管異常而在子宮內(nèi)死亡，但RAMP3敲除小鼠正常出生，且未被發(fā)現(xiàn)明顯異常，表明CRLR/RAMP2和CRLR/RAMP3具有不同的功能[5]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與尿路上皮組織相比，RAMP2在膀胱癌組織中上調(diào)，并且與不良預(yù)后相關(guān)。然而，尿路上皮組織和膀胱癌組織都具有較強(qiáng)的RAMP3表達(dá)，且膀胱癌中的RAMP3表達(dá)對(duì)患者的存活無(wú)明顯影響。由于RAMP2與CRLR形成特異性AM受體，因此我們推測(cè)RAMP2可能是膀胱癌中AM信號(hào)的下游關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。

綜上所述，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)AM廣泛表達(dá)于膀胱癌細(xì)胞及膀胱癌間質(zhì)細(xì)胞，表明腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均是膀胱癌微環(huán)境中AM的來(lái)源。RAMP2在膀胱癌組織高表達(dá)并與患者不良預(yù)后有關(guān)，提示RAMP2是膀胱癌中AM信號(hào)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，并可能參與了膀胱癌進(jìn)展。后續(xù)研究將進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型等來(lái)明確AM/CRLR/RAMP2信號(hào)在膀胱癌進(jìn)展中的詳細(xì)作用及分子機(jī)制。