靳曉飛 高維娟

(河北中醫(yī)學(xué)院 河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點實驗室，河北 石家莊 050091)

腦卒中具有發(fā)病突然、起病急驟、致殘率高和死亡率高等特點，尤其是60歲以上的老年人則具有更高的發(fā)病率和死亡率〔1〕。腦卒中主要包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類，其中缺血性腦卒中的發(fā)病率和致死致殘率不斷攀升，占全部腦卒中的60%～80%〔2,3〕。缺血性腦卒中的發(fā)生機制十分復(fù)雜，涉及興奮性氨基酸毒性、鈣離子超載、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙等，且這些因素相互影響相互聯(lián)系，形成惡性循環(huán)，最終造成不可逆性腦損傷〔4,5〕。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙是缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，因線粒體功能障礙所引起的線粒體自噬與缺血性腦卒中密不可分。

1 線粒體自噬與缺血性腦卒中

1.1細(xì)胞自噬的概念 自噬是指在自噬相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)下，由脫落的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或高爾基體膜與細(xì)胞內(nèi)損傷的細(xì)胞器或異常的蛋白質(zhì)相結(jié)合，形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，進而與溶酶體逐漸融合，形成自噬溶酶體，隨后通過溶酶體酶降解其所包裹的內(nèi)容物，從而實現(xiàn)組織細(xì)胞的代謝需要或某些細(xì)胞器的更新〔6〕。隨著對自噬的深入研究發(fā)現(xiàn)，自噬包括多種形式，目前已發(fā)現(xiàn)至少有5種選擇性自噬類型：線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬、核糖體自噬、過氧化物酶自噬和異源自噬等。各個類型的自噬參與了機體的不同生理過程，在維持組織和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著非常重要的作用。

1.2線粒體自噬的概念和過程 線粒體自噬是指細(xì)胞通過自噬調(diào)控機制選擇性清除損傷或功能障礙線粒體的過程，對于調(diào)節(jié)線粒體功能和維護細(xì)胞生存具有重要作用〔7,8〕。有研究指出，線粒體自噬的過程可分為兩個階段，即線粒體自噬“兩步模型”〔9〕。第一階段：受損或功能障礙的線粒體和自噬相關(guān)基因ATG上游調(diào)控蛋白集聚于自噬小體結(jié)合位點。線粒體受損后，其外膜調(diào)節(jié)蛋白將激活PINK1/Parkin調(diào)控的泛素化反應(yīng)，泛素化的線粒體和自噬相關(guān)基因ATG上游調(diào)控蛋白與自噬小體結(jié)合位點發(fā)生耦聯(lián)。該過程不需要隔離膜參與，同時也不依賴于微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC3)-Ⅱ；第二階段：形成自噬小體。受損的線粒體被隔離膜逐漸包裹，形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，被包裹的線粒體在溶酶體酶的作用下被降解利用。該過程不僅需要LC3-Ⅱ及連接LC3與線粒體的接頭蛋白p62、optineurin、NBR1的參與，同時FUNDC1、Nix/BNIP3、SMURF1等在這一階段也發(fā)揮了關(guān)鍵作用。線粒體自噬作為自噬的重要形式之一，在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、增殖、分化、遺傳、衰老和死亡等細(xì)胞進程中發(fā)揮重要作用，是控制線粒體質(zhì)量的重要機制。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬與阿爾茨海默病、帕金森病和亨延頓病等神經(jīng)退行性疾病，心腦血管病、內(nèi)分泌疾病、固有免疫疾病、惡性腫瘤等密切相關(guān)，且其在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程中更是扮演著不可替代的角色〔10〕。

1.3線粒體自噬在缺血性腦卒中的神經(jīng)保護作用 線粒體作為“細(xì)胞的動力室”，不僅可以產(chǎn)生(ATP)為機體提供能量，而且在控制活性氧(ROS)產(chǎn)生、維持鈣穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)滲透壓、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號等方面均起著重要作用。缺血性腦卒中最直接的損傷是腦內(nèi)能量供給急劇減少，同時引起線粒體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能破壞，從而進一步加劇細(xì)胞能量代謝障礙。受損的線粒體在缺血再灌注期間還可產(chǎn)生大量ROS，加重氧化損傷，引起鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。缺血性腦卒中發(fā)生后，在引起線粒體損傷的同時也激活了線粒體自噬，線粒體自噬可通過及時識別和清除損傷的線粒體和異常的蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)線粒體功能，控制線粒體質(zhì)量，發(fā)揮神經(jīng)保護作用〔11〕。

Zuo等〔12〕采用大鼠局灶性大腦中動脈閉塞法建立缺血性腦卒中模型，并通過腹腔注射葡萄糖模擬缺血性腦卒中發(fā)病后的高血糖狀態(tài)，觀察了線粒體自噬和高血糖對腦缺血大鼠的影響，發(fā)現(xiàn)輕度高血糖大鼠腦缺血損傷程度并不加重，而重度高血糖可通過抑制線粒體自噬，使清除受損線粒體的功能發(fā)生障礙，引起細(xì)胞能量代謝障礙和線粒體途徑細(xì)胞凋亡損傷，神經(jīng)功能缺損和腦梗死容積均明顯加重，表明線粒體自噬可發(fā)揮神經(jīng)保護作用。Zhang等〔13〕采用氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖法建立神經(jīng)元體外缺血/再灌注損傷模型，應(yīng)用特異性熒光染色對自噬小體和線粒體進行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)模型組中自噬小體和線粒體的熒光標(biāo)記大量重疊，而正常對照組中熒光標(biāo)記重疊很少，表明線粒體自噬在氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖神經(jīng)元中被明顯激活。為進一步研究線粒體自噬在缺血性腦卒中的作用，Zhang等〔13〕采用小鼠短暫性大腦中動脈閉塞法建立在體缺血性腦卒中模型，并于缺血再灌注的同時給予自噬抑制劑3-MA側(cè)腦室注射處理，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，3-MA給藥組小鼠腦梗死容積明顯增加，同時自噬相關(guān)蛋白Beclin1和ATG7表達降低，自噬小體和線粒體熒光重疊明顯減少，表明線粒體自噬在缺血再灌注期間發(fā)揮保護作用。Li等〔14〕通過建立大鼠短暫性缺血性腦卒中模型，于缺血再灌注的同時給予自噬激活劑雷帕霉素處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素給藥組線粒體自噬明顯增強，腦梗死容積和線粒體功能障礙均顯著減輕，進一步證實了線粒體自噬對缺血性腦卒中可發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

2 PINK1/Parkin與線粒體自噬

目前研究，哺乳動物體內(nèi)調(diào)控線粒體自噬的機制主要有兩種方式：Parkin依賴性途徑和Parkin非依賴性途徑。其中，Parkin依賴性途徑是指由線粒體外膜蛋白酶PINK1與E3泛素連接酶Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬；而Parkin非依賴性途徑主要是指由NIX/BNIP3信號通路介導(dǎo)的線粒體自噬和FUNDC1信號通路介導(dǎo)的線粒體自噬〔15，16〕。Parkin依賴性途徑，即PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，作為調(diào)控線粒體自噬的經(jīng)典通路，目前研究最為廣泛也是研究最清楚的線粒體自噬信號通路，其在調(diào)控線粒體自噬和維持線粒體功能方面發(fā)揮著重要作用。

2.1PINK1的結(jié)構(gòu)與作用 PINK1是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由581個氨基酸組成，在哺乳動物各組織器官中廣泛表達，尤其在神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和骨骼肌中含量豐富。PINK1氨基酸序列根據(jù)其功能不同可分為四個區(qū)域：N端線粒體靶定信號肽、線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移終止信號肽、絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、C端線粒體外膜滯留信號肽〔17〕。正常情況下，PINK1在線粒體外膜轉(zhuǎn)運酶的作用下，由線粒體外膜不斷被轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜，被線粒體內(nèi)膜上的早老素菱形蛋白(PARL)不斷切割分解，因此正常線粒體中的PINK1表達較低，不容易被檢測到〔18〕。但是，當(dāng)線粒體受損，膜電位出現(xiàn)去極化時，PINK1不能被順利轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜，無法被相關(guān)蛋白酶降解利用，而是集聚在線粒體外膜，并將招募Parkin到受損線粒體。

2.2Parkin的結(jié)構(gòu)與作用 Parkin是一種E3泛素連接酶，擁有465個氨基酸，根據(jù)其氨基酸序列功能不同可分為五個區(qū)域：N端泛素樣結(jié)構(gòu)域、RING0結(jié)構(gòu)域、RING1結(jié)構(gòu)域、RING1與RING2之間的IBR結(jié)構(gòu)域、RING2結(jié)構(gòu)域。其中，N端泛素樣結(jié)構(gòu)域的功能主要包括識別細(xì)胞基質(zhì)、結(jié)合SH3、聯(lián)合蛋白酶體、調(diào)節(jié)泛素蛋白和Parkin活性等〔19〕。正常情況下，Parkin主要通過兩種調(diào)控機制維持自身穩(wěn)定狀態(tài)：①在RING2結(jié)構(gòu)域和IBR結(jié)構(gòu)域之間存在抑制序列，即Parkin抑制因子，該抑制因子可阻斷E2結(jié)合位點與RING1結(jié)構(gòu)域之間的聯(lián)系；②RING0結(jié)構(gòu)域?qū)⑽挥赗ING2結(jié)構(gòu)域上的泛素蛋白酶結(jié)合位點半胱氨酸遮蓋起來，半胱氨酸無法發(fā)揮催化作用，從而維持Parkin自身穩(wěn)定抑制狀態(tài)。當(dāng)線粒體受損時，Parkin的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，半胱氨酸暴露，催化作用啟動，Parkin獲取磷酸化催化活性，活化的Parkin可催化位于線粒體外膜和胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)引起泛素化修飾，泛素化的線粒體在多種自噬相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)下，被具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬囊泡包裹，形成線粒體自噬小體，隨后線粒體自噬小體與溶酶體逐漸融合，形成線粒體自噬溶酶體，被包裹的受損線粒體在溶酶體酶的作用下被降解和利用，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定〔20～22〕。

2.3PINK1/Parkin介導(dǎo)線粒體自噬對缺血性腦卒中的作用 大量研究證實，PINK1和Parkin在同一條基因通路上發(fā)揮作用，PINK1位于Parkin上游，二者相互作用可誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生〔23～25〕。缺血性腦卒中引起線粒體損傷時，PINK1作為受損線粒體的分子探測器，可及時感應(yīng)受損線粒體膜電位的下降，穩(wěn)定集聚在線粒體外膜，招募Parkin轉(zhuǎn)位到受損線粒體，誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生，使受損線粒體被線粒體-自噬-溶酶體途徑降解和利用〔24,26〕。另外，PINK1和Parkin之間相互作用并保持著相對平衡，該相對平衡作用在重建線粒體膜電位、提高信號傳導(dǎo)效率、防止線粒體自噬過度引起自噬性損傷，建立嚴(yán)格的線粒體質(zhì)量調(diào)控機制等方面具有重要意義〔27，28〕。

Safarpour〔29〕應(yīng)用缺血性神經(jīng)元，初步觀察了PINK1和Parkin在缺血性神經(jīng)元中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，敲除PINK1或Parkin基因均可引起神經(jīng)元興奮性氨基酸毒性反應(yīng)，PINK1和Parkin任一基因缺失均可加重神經(jīng)元損傷，提示PINK1/Parkin對缺血性腦卒中可能發(fā)揮著重要作用。Wu等〔30〕應(yīng)用大鼠海馬神經(jīng)元通過氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖法建立缺血性腦卒中細(xì)胞模型，在離體細(xì)胞水平，觀察了H2、自噬激活劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-MA對氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元的影響，探討了PINK1/Parkin信號通路介導(dǎo)線粒體自噬在缺血性腦卒中的保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2和雷帕霉素均可提高細(xì)胞活性，抑制ROS水平和細(xì)胞凋亡率，而經(jīng)3-MA處理后的神經(jīng)元，其細(xì)胞活性明顯降低，ROS水平和細(xì)胞凋亡率明顯上升；隨后，進一步觀察了線粒體膜電位(MMP)和線粒體自噬情況，發(fā)現(xiàn)H2和雷帕霉素對MMP的丟失有保護作用，同時可增加線粒體與GFP-LC3的共定位，提示線粒體自噬的發(fā)生，而3-MA則具有相反的作用；最后，檢測了線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、PINK1和Parkin的表達，發(fā)現(xiàn)H2和雷帕霉素可顯著誘導(dǎo)氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元LC3-Ⅱ、PINK1和Parkin的表達，而3-MA可抑制LC3-Ⅱ、PINK1和Parkin的表達，表明PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元中可發(fā)揮神經(jīng)保護作用。Rui等〔31〕采用大腦中動脈閉塞法建立缺血性腦卒中大鼠模型，在動物水平，觀察了缺血性腦卒中大鼠腦梗死體積及LC3、Beclin1、LAMP-1、PINK1和Parkin的表達水平，探討了PINK1/Parkin信號通路介導(dǎo)線粒體自噬對缺血性腦卒中大鼠的作用。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血再灌注不同時間點均可導(dǎo)致大腦中動脈區(qū)域梗死，并伴有全腦損傷；LC3B、Beclin1和LAMP-1再灌注后表達不斷上調(diào)，并在再灌注24 h達到高峰；此外，再灌注24 h時線粒體外膜PINK1表達明顯增加，Parkin線粒體易位增加；而當(dāng)給予PINK1抑制劑處理后，大鼠腦梗死體積明顯增加，Parkin線粒體易位減少，LC3B、Beclin1和LAMP-1表達降低。該研究結(jié)果進一步證實了PINK1/Parkin信號通路通過介導(dǎo)線粒體自噬參與了缺血性腦卒中的病理生理過程，并且在其中發(fā)揮保護作用。

因此，PINK1/Parkin信號通路介導(dǎo)的線粒體自噬在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著不可替代的作用。如果能夠準(zhǔn)確調(diào)控PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，很可能會找到防治缺血性腦卒中新的治療靶點和作用機制。

3 小結(jié)與展望

缺血性腦卒中是危害人類健康的常見病，特別是60歲以上的老年人具有更高的發(fā)病率和死亡率，如何有效降低缺血性腦卒中的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)成為臨床上亟待解決的客觀難題。缺血性腦卒中發(fā)生后，可嚴(yán)重破壞線粒體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能，引起細(xì)胞能量代謝障礙，甚至引發(fā)惡性級聯(lián)反應(yīng)。線粒體自噬在缺血性腦卒中發(fā)生后可以應(yīng)激性被激活，及時清理受損線粒體和功能異常的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。PINK1/Parkin是介導(dǎo)線粒體自噬的關(guān)鍵通路，在調(diào)節(jié)線粒體自噬和維持線粒體質(zhì)量等發(fā)面發(fā)揮著重要作用。PINK1作為受損線粒體的分子探測器，能夠準(zhǔn)確識別線粒體受損，引導(dǎo)Parkin轉(zhuǎn)位到受損的線粒體，激活PINK1/Parkin和自噬相關(guān)信號通路，誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生，使受損的線粒體被線粒體-自噬-溶酶體途徑降解和利用，最終達到拮抗缺血性腦卒中的目的。然而，隨著對線粒體自噬和缺血性腦卒中的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬是一把“雙刃劍”，其在缺血性腦卒中的作用可能與腦缺血時間、缺血程度及再灌注不同病理過程密切相關(guān)，過度線粒體自噬可引起自噬性細(xì)胞損傷，加重缺血性腦卒中〔32,33〕。因此，如何更加精準(zhǔn)地調(diào)控PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，甚至應(yīng)用某些藥物進行干預(yù)，充分發(fā)揮PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在缺血性腦卒中的神經(jīng)保護作用，將是我們進一步努力研究的方向。