晏子友，萬(wàn)鳴宏，楊 林，楊蕓琪，黃 偉，沈金峰，羅富里，皮持衡

慢性缺氧是慢性腎臟病病理改變的主要原因之一，在慢性缺氧過(guò)程中腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cell，RTEC)凋亡會(huì)誘發(fā)腎小管壞死，加速慢性腎臟病進(jìn)展[1-2]。自噬最初描繪成吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解內(nèi)容物以獲取能量的過(guò)程，可能與多種疾病的發(fā)生有關(guān)[3-5]。在腎臟病早期機(jī)體遠(yuǎn)端組織和器官可出現(xiàn)生物學(xué)行為改變，在腎臟病患者中肺、心臟均可出現(xiàn)自噬，但機(jī)制尚不明確[6]。目前已證實(shí)在慢性腎臟病早期即可出現(xiàn)微小核糖核酸(microRNA，miRNA)的差異性表達(dá)，miRNA與細(xì)胞自噬等多種生物學(xué)行為密切相關(guān)[7]。外泌體是細(xì)胞和臟器傳遞生物學(xué)信息的重要媒介，外泌體中含有的miRNA是外泌體干預(yù)細(xì)胞功能的主要機(jī)制，也可能是腎臟細(xì)胞溝通遠(yuǎn)端臟器的樞紐，可能是腎臟病患者遠(yuǎn)端臟器組織自噬的主要原因[8]。該研究采用體外缺氧模型培養(yǎng)RTEC，探討缺氧狀態(tài)下RTEC外泌體中自噬相關(guān)miRNA分泌情況。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑大鼠RTEC株(NRK-52E) 購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢CCTC公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自上海賽默飛世爾科技有限公司；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒/PCR試劑盒、cel-miR 39購(gòu)自北京天根生化科技有限公司、BCA蛋白濃度試劑盒購(gòu)自北京碧云天生態(tài)園林科技有限公司；ExoQuick-TC 外泌體提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)SBI公司。

1.2 miRNA的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)利用mi-croRNA.org、Target Scan、miRanda及PicTar等生物信息學(xué)軟件查閱文獻(xiàn)確定將 miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、miRNA-183、miRNA-200a作為自噬相關(guān)miRNA研究對(duì)象。

1.3 RTEC干預(yù)和外泌體提取缺氧干預(yù)與分離外泌體：采用無(wú)外泌體的10%FBS培養(yǎng)基分皿接種培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞，待細(xì)胞融合達(dá)60%后換用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h同步化，后換含無(wú)外泌體1% FBS培養(yǎng)基并分別放入常氧(37 ℃、21%O2、5% CO2)、缺氧(37 ℃、1%O2、5%CO2)培養(yǎng)箱培48 h，收集兩2組細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入2 ml的 ExoQuick -TC沉淀液，反復(fù)顛倒3次使其混勻；冷藏(4 ℃)過(guò)夜(12 h)； 10 000 r/min離心ExoQuick-TC 混合液 30 min。離心后外泌體沉淀位于試管底部，呈淺褐色或白色。

1.4 外泌體和細(xì)胞蛋白濃度取2組重懸液，據(jù)BCA試劑盒說(shuō)明書操作，最后在562 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各樣品孔吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算外泌體蛋白濃度；同時(shí)測(cè)定常氧及缺氧RTEC的蛋白濃度，計(jì)算外泌體蛋白濃度與細(xì)胞蛋白濃度比值。

1.5 RT-PCR檢測(cè)腎臟細(xì)胞外泌體中miRNA表達(dá)量取等蛋白量的常氧及缺氧外泌體各加入5 pmol的cel-miR 39作為外參，根據(jù)北京天根試劑盒說(shuō)明書提取外泌體總RNA，反轉(zhuǎn)錄并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、 miRNA-183、miRNA-200a的表達(dá)量，以上miRNA引物由北京天根公司設(shè)計(jì)合成。

1.6 外泌體的鑒定采用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞后離心去上清液為總蛋白，變性后每孔加入30 μg總蛋白行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%牛血清白蛋白BSA室封閉60 min，孵育一抗過(guò)夜，加入二抗室溫孵育60 min，掃描成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩樣本比較，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；方差齊的多樣本均數(shù)的比較使用單因素方差分析，多重比較使用LSD法；方差不齊的多樣本均數(shù)的比較使用Welch法，多重比較使用 Dunnetts T3法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧對(duì)外泌體基本特征的影響以細(xì)胞蛋白為陽(yáng)性參照，2組重懸后Western blot結(jié)果均提示表達(dá)外泌體標(biāo)志性蛋白CD63，見圖1；取離心后沉淀重懸后電鏡下觀察，鏡下常氧和缺氧組囊泡均可見圓形或橢圓形的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，有完整的薄膜，直徑在60～150 nm，多個(gè)視野對(duì)比，均未見明顯異常，見圖2。

圖1 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞外泌體標(biāo)志物CD63的表達(dá)

圖2 2組大鼠外泌體形態(tài)的比較A：常氧組；B：缺氧組

2.2 缺氧對(duì)外泌體分泌量的影響隨著時(shí)間進(jìn)展，12、24、48 h常氧組和缺氧組外泌體總蛋白均增加，差異有統(tǒng)計(jì)意義，但2組細(xì)胞對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分泌的外泌體總蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；12、24、48 h外泌體總蛋白用對(duì)應(yīng)的細(xì)胞蛋白標(biāo)化，結(jié)果顯示12、24 h時(shí)缺氧組外泌體/細(xì)胞蛋白比值較常氧組無(wú)明顯變化，48 h時(shí)缺氧組外泌體/細(xì)胞蛋白比值相較常氧組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 缺氧對(duì)外泌體分泌量的影響

與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)缺氧組比較：*P<0.05

表2 缺氧對(duì)外泌體中自噬相關(guān)miRNA表達(dá)譜的影響

與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)缺氧組比較：*P<0.05

2.3 缺氧對(duì)外泌體中自噬相關(guān)miRNA表達(dá)量的影響缺氧組患者血清中miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、miRNA-183、miRNA-200a水平明顯增高，而且高于常氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而常氧組miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、miRNA-183、miRNA-200a含量無(wú)明顯變化，見表2。

3 討論

缺氧是急慢性腎臟病患者的主要病理生理機(jī)制之一。越來(lái)越多的研究[9-11]證實(shí)急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)甚少單獨(dú)發(fā)生，并且腎損傷與遠(yuǎn)端臟器(肺、肝、心、腦、消化道、骨髓)等之間存在復(fù)雜的交互作用。本研究在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)腎小管上皮模擬AKI過(guò)程中腎臟細(xì)胞缺血缺氧的過(guò)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境下腎臟細(xì)胞分泌外泌體的量明顯增多，并且隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，外泌體的含量逐漸上升。這可能是細(xì)胞對(duì)外環(huán)境改變釋放的一種信號(hào)。

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，是生物在發(fā)育、衰老的過(guò)程中存在的一個(gè)消除自身多余或者受損細(xì)胞器以及維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的共同機(jī)制[12]。 在急慢性腎臟病疾病模型中心臟、肺、肌肉多數(shù)遠(yuǎn)端臟器和組織均存在自噬的現(xiàn)象[13]。目前腎臟病患者遠(yuǎn)端臟器功能改變的具體機(jī)制尚不完全明確，可能與細(xì)胞炎癥因子浸潤(rùn)、尿毒癥毒素侵襲有關(guān)，此外遺傳信息的傳遞可能在遠(yuǎn)端臟器行為改變中存在重要的臨床意義[14-15]。外泌體是細(xì)胞分泌的囊泡，攜帶多種生物學(xué)信息，是溝通遠(yuǎn)端細(xì)胞的主要媒介，可能參與急慢性腎損傷中遠(yuǎn)端臟器功能損傷。當(dāng)AKI發(fā)生時(shí)腎臟細(xì)胞分泌大量miRNA，這些miRNA由外泌體包裹并被釋放入血，可能對(duì)遠(yuǎn)端臟器、細(xì)胞生物學(xué)行為造成影響。本研究建立體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞模型，定量檢測(cè)自噬相關(guān)miRNA表達(dá)量的影響，結(jié)果證實(shí)隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)外泌體中miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、miRNA-183、miRNA-200a發(fā)現(xiàn)了顯著變化，這意味著細(xì)胞外環(huán)境改變可能導(dǎo)致細(xì)胞外泌體中miRNA表達(dá)譜改變，進(jìn)而可能影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，通過(guò)進(jìn)一步分析不同缺氧時(shí)間段患者miRNA表達(dá)譜的關(guān)系，結(jié)果提示隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，miRNA表達(dá)量明顯上升。提示外泌體中miRNA表達(dá)與腎臟病變的程度密切相關(guān)，而此類miRNA在外泌體的包裹下可能導(dǎo)致影響遠(yuǎn)端臟器的行為，干預(yù)機(jī)體重要臟器的生物學(xué)行為，這可能是腎臟病早期遠(yuǎn)端臟器發(fā)生適應(yīng)性變化的重要原因。

本研究關(guān)注的是外泌體中miRNA表達(dá)譜在缺氧時(shí)量的上升與腎臟疾病重要臟器的自噬行為有一定程度關(guān)聯(lián)，但是否還有血液中其他因素的影響，還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，缺氧可以影響腎臟細(xì)胞外泌體的分泌，影響外泌體的量和外泌體中包裹的miRNA的表達(dá)，缺氧環(huán)境下證實(shí)外泌體中自噬相關(guān)miRNA表達(dá)均明顯上調(diào)，缺氧環(huán)境下RTEC外泌體中自噬相關(guān)miRNA表達(dá)上調(diào)可能參與重要臟器的生物學(xué)行為，這為進(jìn)一步研究慢性腎臟病患者重要臟器自噬行為奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。