,*

(1.華東理工大學(xué)，生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心,上海 200237; 2.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,浙江杭州 310014)

色氨酸是一種重要的芳香族氨基酸,具有獨(dú)特的吲哚側(cè)鏈[1],含有三種異構(gòu)體,分別是L-型、D-型、DL-型,較常見且研究最多的是L-色氨酸。L-色氨酸對(duì)人類和動(dòng)物而言屬于八大必需氨基酸中的第二必需氨基酸,在神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和動(dòng)物飼料添加劑的制作加工業(yè)[2],主要用于食品添加劑。此外,因其與金屬離子可以發(fā)生鰲合作用,具有抗氧化活性,可作為食品防腐劑和保鮮劑[3]。所以對(duì)于提升色氨酸產(chǎn)能水平的探索意義重大。

L-色氨酸可通過生物轉(zhuǎn)化、酶法和微生物發(fā)酵等途徑得到[4],利用大腸桿菌或谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)是目前使用最多的、綜合效益較高的方法[5]。日本協(xié)和發(fā)酵利用基因工程重組菌生產(chǎn)放大后L-色氨酸最高產(chǎn)量達(dá)到66 g/L,為目前行業(yè)報(bào)道的最高發(fā)酵水平,國(guó)內(nèi)企業(yè)的L-色氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸水平為25 g/L左右[6]。據(jù)近十年的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),全球色氨酸的年需求量達(dá)到5萬噸,產(chǎn)量只有1萬噸左右,色氨酸的產(chǎn)量基本是供不應(yīng)求的狀態(tài)[7]。色氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的理論得率為0.227 g/g Glu[8],這一最大產(chǎn)量表明,理論上葡萄糖中不超過36.7%的碳可以轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-色氨酸,其余的碳則被生物量增長(zhǎng)和細(xì)胞呼吸等其他活動(dòng)所消耗,因此,利用發(fā)酵工藝生產(chǎn)L-色氨酸，底物利用效率較低,這直接降低了潛在的工藝盈利能力[9]。除了菌株的選擇,培養(yǎng)基的成分對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)而言至關(guān)重要,培養(yǎng)基的成分及配比合適與否,對(duì)微生物的生長(zhǎng),發(fā)酵產(chǎn)品的生物合成、提取,甚至最后對(duì)成品的產(chǎn)量、質(zhì)量都會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。

本文對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-色氨酸初始發(fā)酵培養(yǎng)基開展了基礎(chǔ)研究,在單因素優(yōu)化篩選的基礎(chǔ)上,采用一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法找到影響發(fā)酵的關(guān)鍵培養(yǎng)基組分,得到了該菌株優(yōu)化后的初始發(fā)酵培養(yǎng)基組合,提升了單位菌體L-色氨酸的比合成速率。為進(jìn)一步優(yōu)化色氨酸的合成效率、轉(zhuǎn)化率提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌 浙江工業(yè)大學(xué)微生物菌種保藏室提供;葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、一水檸檬酸、七水硫酸鎂、酵母粉、氯化鈉、蛋白胨、瓊脂粉、乙酸銨、玉米漿、氫氧化鈉等 均為分析純,凌峰化學(xué)試劑有限公司;L-色氨酸 優(yōu)級(jí)純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-2012PC型紫外可見分光光度計(jì) 美國(guó)Unico公司;TDL-80-2B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;BSA224S-CW電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;DHP-9012電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;ZHWY-3212搖床 上海志誠(chéng)儀器儀表有限公司;5 L發(fā)酵罐 上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司;SBA-40E生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海華連醫(yī)療器械有限公司;DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;YXQ-LS-SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;AGILENT 1100 series高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方 種子平板活化培養(yǎng)基:1%蛋白胨,0.5%酵母提取物,1%氯化鈉,2%瓊脂粉,pH7.0。

種子搖瓶培養(yǎng)基:3%葡萄糖,0.5%硫酸銨,2.4%磷酸氫二鉀,0.96%磷酸二氫鉀,1.52%酵母提取物,0.1%七水硫酸鎂,pH7.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基:0.5%葡萄糖,0.22%硫酸銨,1.05%磷酸二氫鉀,0.28%一水檸檬酸,0.28%七水硫酸鎂,0.2%酵母提取物,pH6.5。

微量元素:1%七水合硫酸亞鐵,0.28%無水亞硫酸鈉,0.063%一水合硫酸錳,0.074%七水合硫酸鋅,0.008%五水硫酸銅,0.04%六水氯化鈷,用于發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 菌種培養(yǎng)方法

1.2.2.1 菌種活化 在無菌條件下,將甘油保種管內(nèi)菌接至四環(huán)素(40 mg/L)抗性的LB固體培養(yǎng)基,37 ℃,培養(yǎng)16 h。

1.2.2.2 種子培養(yǎng) 用接種環(huán)刮取一環(huán)新鮮的菌落接至500 mL圓底三角瓶中,裝液量100 mL,四環(huán)素工作濃度為40 mg/L,8層紗布封口,置巡回式搖床上,220 r/min,35 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。

1.2.2.3 搖瓶發(fā)酵 500 mL圓底三角瓶中裝液量50 mL,發(fā)酵搖瓶在滅菌前需額外加入碳酸鈣0.5 g/L用于短暫維持pH的穩(wěn)定。接種量8%(V/V),8層紗布封口,置巡回式搖床上,220 r/min,35 ℃振蕩培養(yǎng)36 h。

1.2.2.4 5 L罐發(fā)酵 標(biāo)定pH電極,用飽和亞硫酸鈉溶液標(biāo)定溶氧0%。5 L發(fā)酵罐裝液量為 2.5 L,接種前溫度降至35 ℃,攪拌500 r/min,通氣量為3 L/min,定溶氧100%。接種量為8%(V/V),整個(gè)過程中流加25%氨水控制pH(6.5),流加泡敵消泡,調(diào)整轉(zhuǎn)速控制溶氧20%以上。當(dāng)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖耗盡,開始流加質(zhì)量濃度為65%的葡萄糖,起始流加速度1 g/L,溶氧持續(xù)回升,則增加補(bǔ)糖量,控制殘?zhí)菨舛?.01 g/L左右。

1.2.3 培養(yǎng)基成分單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 碳源 在前述初始發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,只改變碳源種類,考察四種不同的常見碳源(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖)對(duì)重組大腸桿菌代謝的影響。以加入等碳元素含量(葡萄糖0.5%)的原則進(jìn)行搖瓶試驗(yàn),分析不同碳源對(duì)菌體生物量、殘?zhí)呛?、pH及L-色氨酸產(chǎn)量的影響。

1.2.3.2 無機(jī)氮源 在前述初始發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,只改變無機(jī)氮源種類,考察四種不同無機(jī)氮源(硫酸銨、硝酸銨、氯化銨和乙酸銨)對(duì)重組大腸桿菌代謝的影響。以加入等氮元素含量(硫酸銨0.22%)的原則進(jìn)行搖瓶試驗(yàn),分析不同的無機(jī)氮源對(duì)單位菌體L-色氨酸產(chǎn)量、菌體生物量及L-色氨酸合成產(chǎn)量的影響。

1.2.3.3 有機(jī)氮源 在前述初始發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,只改變有機(jī)氮源種類,考察八種不同有機(jī)氮源(玉米漿、混合蛋白、酵母粉0810、牛肉膏、酵母粉0835、蛋白胨、酵母粉0815、酵母粉0805)對(duì)重組大腸桿菌代謝的影響。以加入等干物質(zhì)含量0.2%為原則配制,分析其對(duì)單位菌體L-色氨酸產(chǎn)量、菌體生物量及L-色氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響。

1.2.4 Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過采用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以單位菌體L-色氨酸產(chǎn)量和L-色氨酸產(chǎn)量為響應(yīng)指標(biāo),篩選L-色氨酸合成過程中培養(yǎng)基中關(guān)鍵影響成分,選擇培養(yǎng)基成分中的八種重要組分進(jìn)行系統(tǒng)篩選評(píng)估。組分包括:硫酸銨、乙酸銨、玉米漿、酵母粉、一水檸檬酸、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、微量元素,每個(gè)因素分高低兩個(gè)水平,因素水平設(shè)計(jì)見表1。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用Central-Composite Design(CCD)試驗(yàn)設(shè)計(jì),以L-色氨酸產(chǎn)量為響應(yīng)指標(biāo),對(duì)PB實(shí)驗(yàn)篩選出來的三個(gè)相對(duì)重要影響因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析,CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平參見表2。

表2 Central-Composite Design試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels based on central-composite design

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的因子和水平Table 1 Factors and levels designed in Plackett-Burman

1.2.6 種齡對(duì)發(fā)酵的影響 考察不同種齡對(duì)應(yīng)的種子對(duì)優(yōu)化前后培養(yǎng)基發(fā)酵的影響,選擇種齡10、12、14 h時(shí)接入發(fā)酵搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),找到最優(yōu)的移種狀態(tài)。

1.2.7 乙酸銨和玉米漿間歇流加培養(yǎng)工藝設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)分成四組:原始培養(yǎng)基組、優(yōu)化培養(yǎng)基組、流加乙酸銨組、流加乙酸銨和玉米漿組。其中流加乙酸銨組:將培養(yǎng)基中的成分“乙酸銨”單獨(dú)配制,9.75 g乙酸銨定容至200 mL,采用補(bǔ)料間歇流加的方式于36 h補(bǔ)入發(fā)酵罐,乙酸銨液補(bǔ)率8 g/L·h;流加乙酸銨和玉米漿組:將培養(yǎng)基中的成分“玉米漿”和“乙酸銨”分別單獨(dú)配制,7.5 g玉米漿液定容至50 mL,9.75 g乙酸銨定容至150 mL,分別于24、36 h間歇流加補(bǔ)入發(fā)酵液中,玉米漿液補(bǔ)率2 g/L·h,乙酸銨液補(bǔ)率6 g/L·h。

1.2.8 指標(biāo)測(cè)定方法

1.2.8.1 菌體生物量測(cè)定 發(fā)酵液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)于分光光度計(jì)上測(cè)定OD600。

1.2.8.2 殘?zhí)菨舛葴y(cè)定 對(duì)于非還原性的雙糖采用酸水解法使其降解成還原性單糖后,采用DNS法[10]和SBA-40E生物傳感分析儀測(cè)定。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.3613x+0.0461,R2=0.9984。

1.2.8.3 L-色氨酸含量測(cè)定 采用對(duì)二甲胺基苯甲醛比色測(cè)定法[11]。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=207.97x+5.8789,R2=0.9994。

1.2.8.4 乙酸測(cè)定 采用HPLC法測(cè)定[12]。

1.2.8.5 單位菌體L-色氨酸產(chǎn)量計(jì)算 單位菌體L-色氨酸產(chǎn)量=單位體積培養(yǎng)液中L-色氨酸含量/菌體濃度OD600

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。利用Origin 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖分析。使用軟件Design Expert 7.0進(jìn)行因素顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同碳源對(duì)重組菌株發(fā)酵的影響 不同碳源對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵色氨酸的結(jié)果見圖1。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，葡萄糖為碳源的情況下菌體濃度最高,OD600是其他組的1.5～2倍。L-色氨酸的合成量也最大,是其他組的2～4倍。根據(jù)圖1的殘?zhí)羌皃H對(duì)比,蔗糖和乳糖組殘?zhí)呛蚿H較高,說明該菌株對(duì)蔗糖和乳糖的利用度較差,這可能與該菌種分解蔗糖和乳糖的酶系活力低有關(guān)[13]。所以選擇葡萄糖作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用的碳源。

圖1 不同碳源對(duì)L-色氨酸發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on L-tryptophan fermentation

2.1.2 不同無機(jī)氮源對(duì)重組菌株發(fā)酵的影響 不同無機(jī)氮源對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵色氨酸的結(jié)果見圖2。如圖2a,氯化銨為氮源的條件下,菌體OD600值略高于其它氮源,L-色氨酸的產(chǎn)量也同比高于硫酸銨和硝酸銨為氮源的發(fā)酵組,硫酸銨組單位菌體產(chǎn)量略高于氯化銨和硝酸銨組。乙酸銨為氮源時(shí),菌體的濃度比硫酸銨和硝酸銨為氮源的發(fā)酵組低,但L-色氨酸的生成量達(dá)到了1118 mg/L,與其它三種無機(jī)氮源相比,提升了21%以上。尤其是以乙酸銨為氮源時(shí)單位菌體的L-色氨酸合成量最高達(dá)到了175 mg/OD,與其它三種無機(jī)氮源相比整體提升了30%以上(圖2b)?？梢娨宜徜@雖然對(duì)菌的生長(zhǎng)有一定抑制作用,但是對(duì)單位菌體的產(chǎn)量提升有很大的效用?？赡苁且宜徜@中除含有與硫酸銨等量的氮元素外,其還含有兩個(gè)碳原子,在葡萄糖耗盡缺乏碳源時(shí),乙醛酸通路被激活,菌體會(huì)利用乙酸進(jìn)行合成代謝,替代TCA循環(huán)的部分代謝途徑,使菌體更高效地利用碳源,而導(dǎo)致乙酸銨組效果比硫酸銨組效果好,但是在其他文獻(xiàn)中乙酸對(duì)菌體生長(zhǎng)和色氨酸合成均不利[14-15]。鑒于乙酸銨這種物質(zhì)成分的特殊性,選擇硫酸銨和乙酸銨進(jìn)行后續(xù)的顯著因素篩選試驗(yàn)。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

圖2 不同無機(jī)氮源對(duì)L-色氨酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of different inorganic nitrogen sources on L-tryptophan fermentation

2.1.3 不同有機(jī)氮源對(duì)重組菌株發(fā)酵的影響 不同有機(jī)氮源對(duì)重組菌株發(fā)酵的影響見圖3。如圖3a,酵母粉0810最有利于菌的生長(zhǎng),玉米漿組菌濃度最低,低于最高組的30%左右,且有文獻(xiàn)報(bào)道稱玉米漿一般含10%左右的乳酸,且玉米漿的利用會(huì)促進(jìn)大腸桿菌對(duì)乙酸的積累[16],可能都會(huì)對(duì)菌的生長(zhǎng)有一定抑制作用。但是由L-色氨酸的合成來看,圖3a中玉米漿氮源組的L-色氨酸產(chǎn)量最高達(dá)到了1223 mg/L,其次是混合蛋白、酵母粉0810。根據(jù)單位菌體產(chǎn)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知,玉米漿組的單位菌體產(chǎn)量最高達(dá)到了292 mg/OD,遠(yuǎn)高于混合蛋白組的260 mg/OD,比其他氮源組(131～166 mg/OD)相比提升了76%以上。后續(xù)選擇玉米漿和酵母粉0810進(jìn)行顯著性因素分析試驗(yàn)。

圖3 不同有機(jī)氮源對(duì)L-色氨酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of different organic nitrogen sources on L-tryptophan fermentation

2.2 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表4 單位菌體L-色氨酸產(chǎn)量的Plackett-Burman設(shè)計(jì)方差分析Table 4 Results of Plackett-Burman design ANOVA analysis of the production of L-tryptophan in per unit cell

注:*表示顯著(P<0.05);**表示極顯著(P<0.01);表5、表7同。

表5 L-色氨酸產(chǎn)量的Plackett-Burman設(shè)計(jì)方差分析Table 5 Results of Plackett-Burman design ANOVA analysis of the production of L-tryptophan

以單位菌體L-色氨酸產(chǎn)量和L-色氨酸產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo),12組矩陣因素水平組合結(jié)果見表3。以單位菌體L-色氨酸產(chǎn)量(表4)和L-色氨酸產(chǎn)量(表5)為響應(yīng)值的方差分析結(jié)果顯示,乙酸銨和酵母粉對(duì)單位菌體L-色氨酸生物合成影響極顯著(P<0.01),而對(duì)于L-色氨酸產(chǎn)量的影響,表5 的模型不顯著,但在一定程度上可反映出,相對(duì)于PB中的其他因素而言,除乙酸銨外,酵母粉0810是影響最大的一個(gè)因子,其次是玉米漿,且由以上單因素實(shí)驗(yàn)中不同有機(jī)氮源對(duì)L-色氨酸合成影響可知,玉米漿對(duì)L-色氨酸產(chǎn)量的提升也有一定正向調(diào)節(jié)作用,試驗(yàn)選擇乙酸銨、酵母粉0810、玉米漿進(jìn)行后續(xù)CCD考察。本實(shí)驗(yàn)中最高發(fā)酵單位達(dá)到了1369 mg/L,最高單位菌體L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)到了276 mg/OD,可見這些組分的交互搭配對(duì)于提升L-色氨酸產(chǎn)量和產(chǎn)率是至關(guān)重要的。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表6 Central-Composite Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of central-composite design experiments

表7 Central-Composite Design設(shè)計(jì)方差分析Table 7 Results of Central-Composite Design ANOVA analysis

表8 優(yōu)化前后培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵參數(shù)Table 8 Fermentation parameters of original and optimized medium in shake flasks

表9 不同培養(yǎng)時(shí)間種子液培養(yǎng)結(jié)果參數(shù)對(duì)比Table 9 Comparison of parameters for different culture time of seeds

2.4 搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證

各成分最優(yōu)配比為酵母粉0810 0.5 g/L、乙酸銨3.9 g/L、玉米漿3 g/L時(shí),對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值最大,L-色氨酸預(yù)測(cè)值可達(dá)1432 mg/L。

為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性,在預(yù)測(cè)最佳培養(yǎng)基配方條件下進(jìn)行大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-色氨酸重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,優(yōu)化后的培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證結(jié)果見表8,優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)到了1451.30 mg/L,與模型預(yù)測(cè)的值非常接近。與優(yōu)化前的培養(yǎng)基發(fā)酵色氨酸產(chǎn)量(746.23 mg/L)相比提高了94.5%。但是優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵菌體濃度OD600較低,說明此培養(yǎng)基中的某些成分對(duì)菌的生長(zhǎng)有一定抑制作用,但是單位菌體L-色氨酸產(chǎn)量提高了140%,說明優(yōu)化培養(yǎng)基是有利于產(chǎn)物合成的。綜合PB和CCD實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化后培養(yǎng)基組合：0.12%硫酸銨、0.7%磷酸二氫鉀、0.15%一水檸檬酸、0.28%七水硫酸鎂、0.05%酵母粉0810、0.39%乙酸銨、0.3%玉米漿。

2.5 不同種齡對(duì)發(fā)酵的影響

不同種齡種子的培養(yǎng)結(jié)果見表9,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),菌體濃度OD600逐漸上升。10 h后種子進(jìn)入快速生長(zhǎng)期,培養(yǎng)14 h的種子液酸味較重,乙酸含量檢測(cè)結(jié)果顯示種子液已經(jīng)開始積累代謝副產(chǎn)物乙酸,這可能是菌體濃度高的情況下氧限制引起的[18]。

不同種齡的種子接種發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)結(jié)果見圖4。如圖4b原始培養(yǎng)基中,隨著種齡增長(zhǎng),單位菌體L-色氨酸產(chǎn)量略有提高,菌體濃度略有上升(圖4a),所以L-色氨酸產(chǎn)量也逐步上升(圖4c)。優(yōu)化培養(yǎng)基中12 h種齡的種子對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液菌體濃度最高(圖4a),L-色氨酸的產(chǎn)量也高于10和14 h種齡的種子對(duì)應(yīng)的發(fā)酵產(chǎn)量,達(dá)到了1293 mg/L(圖4c),對(duì)應(yīng)的單位菌體L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)到了238 mg/OD(圖4b)。14 h種齡的種子對(duì)應(yīng)的發(fā)酵無論是菌體濃度,還是L-色氨酸產(chǎn)量都明顯低于其他種齡對(duì)應(yīng)的狀態(tài)。發(fā)酵搖瓶的菌體濃度比12 h種齡的對(duì)應(yīng)的發(fā)酵少了35%以上,OD600只有3.3左右,這可能與種子培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)菌體活力下降有關(guān),同時(shí)接入發(fā)酵瓶后乙酸等副產(chǎn)物可能會(huì)抑制了菌的生長(zhǎng)[19]。

相對(duì)于原始培養(yǎng)基,優(yōu)化后培養(yǎng)基L-色氨酸產(chǎn)量有較大提升,但是菌濃略有下降。不同種齡對(duì)優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果影響很大,種齡12 h發(fā)酵L-色氨酸產(chǎn)量最高,菌體生長(zhǎng)代謝較旺盛,綜合考量選擇12 h種齡接入發(fā)酵更有利于菌體合成。

圖4 種齡對(duì)發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of seed age on fermentation

2.6 5 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)

將優(yōu)化培養(yǎng)基與原始培養(yǎng)基在5 L罐上進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)的放大對(duì)比驗(yàn)證,結(jié)果見圖5。各發(fā)酵參數(shù)對(duì)比見表10。

由圖5a可知,使用優(yōu)化后培養(yǎng)基在5 L罐上發(fā)酵菌體的延滯期較長(zhǎng),其整體生長(zhǎng)進(jìn)度延滯了24 h左右。優(yōu)化后培養(yǎng)基菌體的延滯期較長(zhǎng)主要與培養(yǎng)基成分乙酸銨有關(guān),乙酸對(duì)菌體的生長(zhǎng)有抑制作用[14],由于前期高濃度乙酸的存在使得延滯期較長(zhǎng)。菌體在緩慢利用完基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖后,會(huì)啟動(dòng)乙醛酸支路[20],開始消耗發(fā)酵液中的乙酸,且大腸桿菌在外源乙酸的存在下會(huì)傾向于避免自身乙酸的生成,對(duì)發(fā)酵后期的產(chǎn)物合成速率較高有一定幫助[21-22]。

圖5 初始培養(yǎng)基與優(yōu)化培養(yǎng)基5 L罐發(fā)酵參數(shù)對(duì)比Fig.5 Comparison of fermentation parameters between initial medium and optimized medium in 5 L tank

將成分“乙酸銨”改成中后期流加控制,待菌體濃度增長(zhǎng)到一定程度,采用間歇流加方式將乙酸銨補(bǔ)入發(fā)酵液,由圖示5c可知,流加乙酸銨組發(fā)酵液中乙酸含量在36 h后逐漸上升,菌體的生長(zhǎng)速率開始減緩(圖5a),與優(yōu)化培養(yǎng)基組相比，采用流加的方式使菌的生長(zhǎng)延滯期縮短,L-色氨酸產(chǎn)量隨著菌體濃度的快速升高有較大提高(圖5b),發(fā)酵結(jié)束時(shí)，流加乙酸銨組L-色氨酸產(chǎn)量比原始培養(yǎng)基組提高了17%左右,且在發(fā)酵后期L-色氨酸合成速率和單位菌體L-色氨酸產(chǎn)量明顯高于原始培養(yǎng)基組,單位菌體的L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)到了282 mg/OD。說明乙酸銨的合理補(bǔ)加是有利于L-色氨酸的合成的,且采用乙酸銨流加的方式大大改善了高濃度乙酸銨造成的菌體延滯期長(zhǎng)的問題。

菌的延滯期相對(duì)于對(duì)照(原始培養(yǎng)基組)較長(zhǎng),除了與原始培養(yǎng)基中乙酸含量高有關(guān),與有機(jī)氮源玉米漿的量也有很大的關(guān)系,單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示玉米漿添加組菌體生長(zhǎng)量最低,說明玉米漿對(duì)前期菌體的生長(zhǎng)的確是有抑制作用的,因此實(shí)施乙酸銨和玉米漿單獨(dú)流加工藝,發(fā)酵培養(yǎng)24 h后開始流加玉米漿,發(fā)酵36 h時(shí)開始流加乙酸銨。表10結(jié)果表明,這種方法能夠大大縮短菌體生長(zhǎng)的延滯期。

表10 初始培養(yǎng)基與優(yōu)化培養(yǎng)基5 L罐發(fā)酵參數(shù)Table 10 Fermentation parameters of initial medium and optimized medium in 5 L tank

在發(fā)酵中后期,流加乙酸銨和玉米漿組依然能夠維持菌體濃度較高的比生長(zhǎng)速率,由色氨酸產(chǎn)量曲線變化斜率可知，L-色氨酸合成速率也明顯提升,玉米漿和乙酸銨相結(jié)合的氮源補(bǔ)加方式使得發(fā)酵L-色氨酸產(chǎn)量提高了35%,糖酸轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到了14.25%,比原始培養(yǎng)基組(11.26%)提高了27%。說明采用這種分批補(bǔ)料的方式可以進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵過程,提升了發(fā)酵效能。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化了大腸桿菌產(chǎn)L-色氨酸原初始發(fā)酵培養(yǎng)基組合成分,以及對(duì)移種時(shí)間進(jìn)行選擇,從而提高了L-色氨酸的合成量,并最終在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行驗(yàn)證,針對(duì)在罐上放大出現(xiàn)的延滯期長(zhǎng)的問題,本文提出了一種新型的補(bǔ)料優(yōu)化模式,實(shí)施了乙酸銨和玉米漿流加控制工藝。這種方法能夠大大縮短菌體生長(zhǎng)的延滯期,在發(fā)酵中后期,依然能夠維持較高的比生長(zhǎng)速率,色氨酸合成速率也明顯提升,玉米漿和乙酸銨相結(jié)合的氮源補(bǔ)加方式能促使L-色氨酸產(chǎn)量提高35%,糖酸轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到14.25%,比原始培養(yǎng)基組提高了27%,優(yōu)化效果顯著,為菌體合成L-色氨酸培養(yǎng)基開發(fā)、補(bǔ)料工藝研究提供一定參考。本文使用低成本的有機(jī)氮源玉米漿部分代替酵母粉,以及發(fā)現(xiàn)乙酸銨對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-色氨酸產(chǎn)量提升的特殊作用,目前這只在利用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-色氨酸中簡(jiǎn)單提及,這對(duì)進(jìn)一步提升L-色氨酸產(chǎn)量的探索具有一定研究意義,未來可以從基因分子層面、胞內(nèi)代謝流變化角度進(jìn)一步研究以解釋這種調(diào)控作用,后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步探索補(bǔ)氮條件,對(duì)精準(zhǔn)流加稀釋后的有機(jī)氮源如玉米漿等采取進(jìn)一步優(yōu)化,可能會(huì)有新的成效,為實(shí)現(xiàn)更精確的補(bǔ)氮控制模式奠定基礎(chǔ)。