顆粒細(xì)胞線粒體功能與卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)性的研究進(jìn)展

李貝貝，杜馨，張敏，姜宏

顆粒細(xì)胞的線粒體參與眾多細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝，可利用葡萄糖的代謝產(chǎn)物丙酮酸為卵母細(xì)胞腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）合成提供底物[1]，并保護(hù)卵母細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[2]，正常的線粒體功能及顆粒細(xì)胞-卵母細(xì)胞間的相互作用是卵母細(xì)胞正常發(fā)育的必要條件[3]。本文對近年有關(guān)顆粒細(xì)胞線粒體功能與卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)性的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 卵巢顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞

卵泡是卵巢的基本功能單位，竇卵泡期卵巢顆粒細(xì)胞開始分化，根據(jù)其位置和功能分為兩類，即位于壁層的顆粒細(xì)胞和圍繞卵母細(xì)胞的卵丘顆粒細(xì)胞。前者是卵泡中具有分泌功能的主要細(xì)胞；后者與卵子在結(jié)構(gòu)上緊密連接，形成卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體。在卵泡發(fā)生過程中，顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞共享生長、成熟、衰老及退化信號，卵丘顆粒細(xì)胞可通過向卵母細(xì)胞輸入卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄信號、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、鈣離子及其他代謝物，促使卵母細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)激活，支持卵母細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的成熟，而卵母細(xì)胞可分泌促進(jìn)卵丘顆粒細(xì)胞分化和增殖的生長因子，維持和增強(qiáng)顆粒細(xì)胞功能。

卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞主要通過縫隙連接蛋白43和連接蛋白45進(jìn)行雙向信息交流及新陳代謝物質(zhì)傳遞[4]，縫隙連接的變化可改變卵母細(xì)胞成熟狀態(tài)[5]。此外，卵母細(xì)胞與卵丘顆粒細(xì)胞間部分信號傳遞由配體和受體介導(dǎo)。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，小鼠壁層顆粒細(xì)胞表達(dá)C型鈉肽配體，卵丘顆粒細(xì)胞則存在C型鈉肽受體，兩者結(jié)合可控制卵母細(xì)胞減數(shù)分裂[6]。研究顯示，與成熟卵母細(xì)胞的卵丘顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)后可提高卵母細(xì)胞成熟率，表明卵丘顆粒細(xì)胞在卵母細(xì)胞最終成熟和排卵過程中發(fā)揮不可或缺的作用[7]。

cAMP由腺苷酸環(huán)化酶分解ATP產(chǎn)生，是哺乳動物卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的停止和恢復(fù)，在卵母細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞發(fā)育過程中起重要作用。排卵前，卵丘顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的cAMP可通過縫隙連接運(yùn)送到卵母細(xì)胞內(nèi)，對卵母細(xì)胞核成熟有抑制和促進(jìn)雙重作用，持續(xù)升高的cAMP對卵子成熟起抑制作用，而短暫升高的cAMP則可促進(jìn)卵母細(xì)胞核成熟[8]。哺乳動物中，卵母細(xì)胞cAMP水平的上升可抑制或延遲減數(shù)分裂的恢復(fù)，但這一現(xiàn)象在無卵丘顆粒細(xì)胞的裸卵中則不會發(fā)生[9]。

此外，卵母細(xì)胞還可通過旁分泌調(diào)節(jié)周圍顆粒細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及黃素化，表明在卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過程中，顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞相互影響，缺一不可[10]，卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體間的多條信號通路是卵母細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵因素。

2 線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)

線粒體是一類屬于母系遺傳的細(xì)胞器，為眾多細(xì)胞活動提供能量，并參與活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的管理和細(xì)胞凋亡的調(diào)控，是影響女性生殖過程的重要因素[11]。

MtDNA拷貝數(shù)是指線粒體基因組的數(shù)量，具有細(xì)胞間特異性，與線粒體功能密切相關(guān)，是衡量線粒體功能的重要指標(biāo)。MtDNA通過編碼呼吸鏈的多種組成成分參與細(xì)胞氧化磷酸化及ATP的合成過程，調(diào)控細(xì)胞的代謝和功能。顆粒細(xì)胞通過表達(dá)與mtDNA復(fù)制有關(guān)的信息因子，對卵母細(xì)胞發(fā)育過程中維持足夠的mtDNA起重要作用。研究表明，顆粒細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)與相應(yīng)卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)呈正相關(guān)[12]，卵巢儲備功能下降患者顆粒細(xì)胞凋亡率增高[13]，顆粒細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)顯著低于卵巢儲備功能正?；颊遊12]。此外，卵丘顆粒細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)與胚胎質(zhì)量密切相關(guān)，優(yōu)質(zhì)胚胎的卵丘顆粒細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)顯著高于質(zhì)量較差胚胎的卵丘顆粒細(xì)胞[14]，卵丘顆粒細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)可以較好地預(yù)測體外受精過程中的胚胎質(zhì)量，陽性預(yù)測值為84.4%，陰性預(yù)測值為82.1%[15]。

3 MtDNA突變及缺失

MtDNA 4 977 bp片段缺失是最為常見的mtDNA變異類型，可導(dǎo)致大量線粒體基因缺失，包括ATP酶6和ATP酶8基因、細(xì)胞色素氧化酶和泛醌還原酶相關(guān)基因等[16]，mtDNA 4 977 bp片段基因缺失的積累效應(yīng)可導(dǎo)致線粒體功能障礙、ATP合成受損和細(xì)胞凋亡。

關(guān)于顆粒細(xì)胞中mtDNA是否存在4 977 bp片段缺失的報(bào)道不一。有學(xué)者認(rèn)為卵巢儲備功能正常及卵巢儲備功能下降患者均不存在顆粒細(xì)胞mtDNA 4 977 bp片段缺失[17]，且年齡的升高并不增加卵丘顆粒細(xì)胞mtDNA 4 977 bp片段缺失率[18]。也有學(xué)者認(rèn)為顆粒細(xì)胞存在mtDNA 4 977 bp片段缺失，且女性年齡與mtDNA突變率存在一定的關(guān)聯(lián)，38歲以下婦女顆粒細(xì)胞mtDNA 4 977 bp片段的缺失率為41.7%，而≥38歲婦女缺失率高達(dá)100%[19]。

4 線粒體相關(guān)基因

線粒體相關(guān)基因與其產(chǎn)物在卵母細(xì)胞的形成和發(fā)育中扮演重要角色。卵母細(xì)胞與其周圍的顆粒細(xì)胞間存在復(fù)雜且功能強(qiáng)大的基因通路，可調(diào)控卵母細(xì)胞及胚胎的發(fā)育潛能，卵丘顆粒細(xì)胞線粒體相關(guān)基因表達(dá)水平可作為評估卵母細(xì)胞質(zhì)量的潛在生物標(biāo)志物[20]。

PPARGC1A是調(diào)節(jié)線粒體生物合成的重要基因，有研究發(fā)現(xiàn)卵巢儲備功能下降患者卵丘顆粒細(xì)胞的PPARGC1A基因表達(dá)水平顯著下調(diào)[12]。在卵泡發(fā)育的后期階段，顆粒細(xì)胞中與糖酵解有關(guān)的基因（如磷酸果糖激酶、M2型丙酮酸激酶同工酶、乳酸脫氫酶等）表達(dá)水平均顯著上調(diào)[21]。

線粒體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯依賴核基因編碼的各種蛋白因子的調(diào)控，在哺乳動物中已經(jīng)鑒定出的兩種轉(zhuǎn)錄因子有：線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM） 與線粒體轉(zhuǎn)錄因子B（mitochondrial transcription factor B，TFBM）。在哺乳動物線粒體生成中起到主要調(diào)節(jié)作用的是TFAM。TFAM是由TFAM基因在胞質(zhì)內(nèi)形成的246個(gè)氨基酸組成的小分子多肽，在線粒體靶向序列的轉(zhuǎn)運(yùn)下進(jìn)入線粒體形成TFAM蛋白，TFAM以二聚體形式特異性結(jié)合到線粒體基因組的兩個(gè)主要啟動子——重鏈啟動子（HSP）和輕鏈啟動子（LSP）上游的特定位點(diǎn)，并通過募集線粒體RNA聚合酶和TFBM共同組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，在線粒體中作為mtDNA轉(zhuǎn)錄的激活劑，激活線粒體的生物合成，調(diào)節(jié)mtDNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制，維持mtDNA穩(wěn)定性。因而，TFAM被認(rèn)為是一種具有多效性功能的核基因編碼的DNA結(jié)合蛋白，是生殖細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)的決定因子，可影響卵母細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)，同時(shí)也參與線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的過程[22]。

哺乳動物TFAM基因大小不一，長10～25 kb，一般含有6個(gè)內(nèi)含子、7個(gè)外顯子。TFAM基因啟動子上存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄因子通過與TFAM基因的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而調(diào)控該基因的表達(dá)。因TFAM與mtDNA拷貝數(shù)相關(guān)，被認(rèn)為其可能是治療線粒體相關(guān)疾病的一個(gè)有效靶點(diǎn)，目前已有大量關(guān)于TFAM與線粒體相關(guān)疾病的研究。研究發(fā)現(xiàn)，TFAM有利于卵母細(xì)胞發(fā)育、胚胎生長發(fā)育及提高受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率，推測TFAM可能通過影響卵母細(xì)胞的成熟，尤其是胞質(zhì)成熟，繼而影響體外受精-胚胎移植的妊娠結(jié)局，且TFAM的表達(dá)存在閾值，顆粒細(xì)胞TFAM mRNA水平過低或者過高均會對卵母細(xì)胞質(zhì)量產(chǎn)生影響[23]。推測TFAM可以作為卵母細(xì)胞發(fā)育能力的預(yù)測因子，可能將為臨床和實(shí)驗(yàn)室的輔助生育工作作出貢獻(xiàn)。但顆粒細(xì)胞中TFAM的相關(guān)研究還不多，還需要更多研究證實(shí)。

5 線粒體跨膜電位

線粒體膜上存在通透性轉(zhuǎn)換孔，其是由多個(gè)蛋白質(zhì)組成的復(fù)合孔道，當(dāng)其高水平開放時(shí)可導(dǎo)致線粒體膜電位降低，進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體腫脹，ATP水解，離子穩(wěn)態(tài)被打破，細(xì)胞ATP水平下降，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子水平上升，細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，未成熟的卵母細(xì)胞周圍卵丘顆粒細(xì)胞線粒體膜電位顯著低于成熟卵母細(xì)胞。此外，卵丘顆粒細(xì)胞線粒體膜電位的降低，可影響卵母細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)成熟的同步性[24]。體外受精過程中卵丘顆粒細(xì)胞線粒體膜電位與總獲卵數(shù)、成熟卵母細(xì)胞數(shù)和正常受精卵母細(xì)胞數(shù)、6～8細(xì)胞胚胎數(shù)及囊胚數(shù)呈正相關(guān)[25]。

6 ATP水平

ATP是細(xì)胞能量供給的直接形式。卵母細(xì)胞主要依賴氧化磷酸化獲取能量，顆粒細(xì)胞則主要依靠糖酵解獲得能量，并通過縫隙連接將葡萄糖代謝產(chǎn)物輸送至卵母細(xì)胞，維持卵母細(xì)胞的能量供給。顆粒細(xì)胞ATP水平與卵母細(xì)胞的發(fā)育和質(zhì)量密切相關(guān)，包繞顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞在成熟過程中ATP水平明顯高于裸卵[26]。卵丘顆粒細(xì)胞中高度極化的線粒體是成熟哺乳動物卵母細(xì)胞的重要ATP來源，卵丘顆粒細(xì)胞ATP水平與獲卵數(shù)、成熟卵母細(xì)胞比例、著床率及妊娠結(jié)局密切相關(guān)[27]。

7 ROS水平

ROS是一類來源于細(xì)胞代謝的高活性氧自由基，是氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要標(biāo)志物，是線粒體的產(chǎn)物，亦被當(dāng)作線粒體功能指標(biāo)的一種。在生殖細(xì)胞發(fā)育和成熟過程中，對能量和營養(yǎng)物質(zhì)的需求不可避免地加快了新陳代謝速率，導(dǎo)致ROS積累。生理水平的ROS對卵母細(xì)胞成熟、排卵和早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要。ROS過量則可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體損傷，ATP含量降低，影響卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中紡錘體的形成和基因組的穩(wěn)定，并導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡率增加，而顆粒細(xì)胞凋亡與體外受精-胚胎移植過程中低獲卵率、低受精率、低卵裂率、低妊娠率及空卵泡綜合征的發(fā)生密切相關(guān)[7]。卵泡液的ROS主要來自卵子及其周圍的顆粒細(xì)胞，卵母細(xì)胞膜因?yàn)楦缓嗑鄄伙柡椭舅岣菀资艿絉OS攻擊，及時(shí)有效清除ROS及其產(chǎn)物對于防止ROS進(jìn)入卵母細(xì)胞、保證卵母細(xì)胞正常減數(shù)分裂非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，卵泡液中高ROS水平與獲卵數(shù)、卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)[28]。

8 線粒體功能的改善

目前生殖細(xì)胞線粒體功能的改善方法包括線粒體移植、極體移植、使用線粒體營養(yǎng)劑等。2004年已有學(xué)者將顆粒細(xì)胞線粒體移植到體外受精-胚胎移植反復(fù)妊娠失敗和高齡患者的卵子中，提高了患者的囊胚形成率，且獲得了38.89%的臨床妊娠率，證實(shí)利用自體顆粒細(xì)胞線粒體改善卵子質(zhì)量的可行性，但研究的樣本量較小[29]。在人或動物卵母細(xì)胞中進(jìn)行顆粒細(xì)胞線粒體移植，結(jié)果均證明顆粒細(xì)胞線粒體移植對改善卵母細(xì)胞發(fā)育潛能具有非常重要的作用。

綜上所述，在卵子成熟過程中，顆粒細(xì)胞線粒體作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)最重要的細(xì)胞器，其氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的能力、mtDNA拷貝數(shù)、mtDNA突變或缺失水平、ROS水平、線粒體膜電位、線粒體相關(guān)基因表達(dá)水平等對卵母細(xì)胞發(fā)育成熟有著重要的影響，與卵子發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局密切相關(guān)，可作為評估卵母細(xì)胞質(zhì)量及改善卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的替代細(xì)胞。對卵子成熟過程中顆粒細(xì)胞線粒體功能狀況的研究有助于揭示卵母細(xì)胞發(fā)育的機(jī)制，從而進(jìn)一步了解卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的生殖生理，為改善卵母細(xì)胞發(fā)育潛能提供新的思路。