劉本濤，梁旭華，趙艷艷，賈朝，魏歌龍，周偉，孫金娟，程敏，4

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530200；2.商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，商洛 726000；3.陜西香菊藥業(yè)集團有限公司，商洛 726000；4.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽 712046)

銀花感冒顆粒是國家乙類非處方藥，收載于國家衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)第二冊中，由金銀花、連翹、防風(fēng)、桔梗、甘草五味中藥組成，具有顯著抗病毒、抗菌、解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗變態(tài)反應(yīng)、增加免疫力等作用，主治風(fēng)熱感冒、上呼吸道感染、流行性感冒[1]。原方制劑中含有大量糖分，體積大，易吸潮，易軟化變質(zhì)，給生產(chǎn)、儲運帶來不便，同時含糖制劑不適于伴有糖尿病、高血壓、肥胖等患者使用。為有效解決上述問題，本實驗擬在原方制劑提取、精制工藝不變的基礎(chǔ)上，選用其他輔料替代蔗糖，同時對其成型工藝進行優(yōu)化，制成無糖型顆粒，為該制劑的研制及產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1儀器 DF-206B型電熱鼓風(fēng)干燥箱(陜西省商縣電器廠)；ESJ-205-4型電子分析天平(沈陽龍騰電子，感量：0.1 mg)；標(biāo)準(zhǔn)藥典篩(浙江上虞市道墟張興紗篩廠)。

1.2試藥 提取物浸膏粉(自制)；糊精、可溶性淀粉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：160725，161004)；乳糖(批號：151206)、甘露醇(批號：160813)均由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；微晶纖維素(批號：151103)、羧甲基纖維素鈉(批號： 160521)均由安徽山河輔料有限公司；乙醇為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1浸膏粉的制備 取銀花感冒顆粒處方量藥材，按原方制劑提取工藝提取、除雜、濃縮，于80 ℃烘箱中烘干，打粉備用。

2.2輔料的初步選擇 實驗中使用的浸膏粉黏性較強，且制劑最終為無糖型顆粒劑，因此吸濕性較小的無糖型輔料應(yīng)為首選。可溶性淀粉、糊精、乳糖、甘露醇、微晶纖維素和羧甲基纖維素鈉是目前應(yīng)用較為廣泛的無糖型輔料[2]。課題組將可溶性淀粉、糊精、乳糖、甘露醇、微晶纖維素和羧甲基纖維素鈉作為篩選對象，分別取一定量，于30 ℃烘箱中恒重48 h后稱取2 g ，放入已恒重的扁稱量瓶中，攤開至厚度2 mm，將稱量瓶蓋打開，置于放有相對濕度(relative humidity，RH)75%的過飽和氯化鈉溶液的干燥器中，48 h后稱定質(zhì)量，共做兩組，計算平均吸濕率，結(jié)果見表1。根據(jù)各輔料吸濕率并考慮價格因素，初步選擇糊精、乳糖和甘露醇作為本制劑的成型輔料，進一步考察此3種輔料單一使用、混合使用對顆粒性質(zhì)的影響，最終優(yōu)選出適合本制劑的輔料種類。

表1 輔料在RH75%環(huán)境中吸濕率

Tab.1 Hygroscopic rates of the excipients in RH 75% %

輔料名稱12平均值可溶性淀粉5.685.365.520糊精1.041.121.080乳糖0.100.140.120甘露醇0.010.020.015微晶纖維素3.874.013.940羧甲基纖維素鈉20.4019.8020.100

2.3輔料種類考察 根據(jù)表2中設(shè)計的輔料種類，按輔料與浸膏粉3：2的比例，分別稱取各種輔料，平行加入浸膏粉混合均勻，以適量85%乙醇作為潤濕劑制軟材，過孔徑2.0 mm(10目)篩制粒，記錄制粒情況，于40 ℃干燥2 h，測定顆粒的成型率、吸濕率、休止角和溶化率，并進行綜合評分，篩選出最佳輔料種類，結(jié)果見表2。

2.3.1顆粒成型率的測定 按《中華人民共和國藥典》2015年版通則物理檢查法0982(第二法雙篩分法)進行測定[3]。能通過一號篩且不能通過五號篩的為合格顆粒，顆粒成型率(%) =合格顆粒重量/顆?？傊亓俊?00%。

2.3.2顆粒溶化性的測定 按《中華人民共和國藥典》2015年版制劑通則0104顆粒劑(可溶顆粒檢查法)進行測定[3]。稱取顆粒2 g，加70 ℃熱水40 mL，用磁力攪拌器以固定轉(zhuǎn)速攪拌，秒表記錄顆粒完全溶化所需時間，允許有輕微渾濁。

2.3.3顆粒吸濕率的測定 取一定量的顆粒，于30 ℃烘箱中恒重48 h。在已恒重的扁形稱量瓶中放入厚約2 mm的顆粒，將稱量瓶蓋打開，置于放有RH75%過飽和氯化鈉溶液的干燥器內(nèi)，48 h后稱定質(zhì)量，計算吸濕率。吸濕百分率(%)= (吸濕后稱量瓶及顆粒總質(zhì)量-吸濕前稱量瓶及顆?？傎|(zhì)量)/吸濕前顆粒質(zhì)量×100%[4]。

2.3.4顆粒流動性的測定 采用固定漏斗法，取一已知半徑r的表面皿，在背面中心處劃上標(biāo)記，將一支架平放于桌面上，并使漏斗豎直固定于支架上，漏斗下端正對表面皿的中心[5]。取合格顆粒，使其自漏斗上方自然流下，當(dāng)漏斗下方形成的顆粒椎體邊緣與表面皿邊緣重合為止，測量錐體高度h，顆粒流動性用休止角α評價(α=Arctanh/r)。

2.3.5綜合評分及結(jié)果分析 各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)均為0.25，綜合評分(%)=[粒度/最大粒度×0.25+最小吸濕率/吸濕率×0.25+最小休止角/休止角×0.25+最小溶化率/溶化率×0.25]×100%[6]。根據(jù)表2中數(shù)據(jù)及綜合評分可知，乳糖：甘露醇(1：1)的綜合評分最高，其次是糊精：乳糖：甘露醇(1：1：1)，考慮到價格因素，擬確定選用糊精：乳糖：甘露醇(1：1：1)混合輔料作為本制劑的成型輔料。

2.4輔料的最佳配比篩選 將浸膏粉與糊精、乳糖和甘露醇按表3比例混勻，按“2.3”項下步驟進行制粒，對顆粒的各項指標(biāo)進行測定，篩選出合適的三元輔料配比，實驗結(jié)果見表4。

由表4綜合考察顆粒四項指標(biāo)結(jié)果，1號處方顆粒在外觀、流動性、溶化性和吸濕性檢查項目中最優(yōu)，并考慮到吸濕性對本方的影響較大，最終確定處方1，即浸膏粉：糊精：乳糖：甘露醇=2：0.5：1：1.5為三元混合輔料的最優(yōu)配比。

2.5響應(yīng)曲面優(yōu)化成型工藝

2.5.1單因素考察 選擇輔料用量比(A)，乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)，乙醇用量(C)，考察各因素對顆粒成型的影響。

表2 綜合評分結(jié)果

表3 浸膏粉與三元混合輔料的配比

Tab.3 The ratio of extract powder and ternary mixed excipients

g

表4 混合輔料配比篩選的評價結(jié)果

Tab.4 Evaluation results of the screening on the mixture excipients ratio

處方號外觀成型率/%流動性/(°)吸濕率/%溶化性/s1顏色一致,顆粒均勻,無結(jié)塊、黏糊現(xiàn)象97.131.237.9524.082顏色一致,顆粒均勻,少量結(jié)塊、黏糊94.831.388.8624.843顏色一致,顆粒均勻,無結(jié)塊、黏糊現(xiàn)象98.230.879.3725.624顏色一致,顆粒較細(xì),粉末較多90.430.739.6125.365顏色一致,顆粒均勻,無結(jié)塊、黏糊現(xiàn)象96.730.548.1426.086顏色一致,顆粒均勻,無結(jié)塊、黏糊現(xiàn)象95.130.349.3726.557顏色一致,顆粒均勻,但有白點出現(xiàn)94.830.519.3126.988顏色一致,顆粒均勻,無結(jié)塊、黏糊現(xiàn)象94.630.209.4927.24

2.5.1.1輔料用量比 預(yù)實驗選擇浸膏粉與輔料之比分別為1：0.5，1：1，1：1.5，1：2，1：2.5進行制粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1：0.5和1：2.5難以制粒，1：0.5時顆粒太黏且易板結(jié)；1：2.5時顆粒松散細(xì)粉多，均易結(jié)塊黏糊，可能是輔料太少或太多；比例為1：1，1：1.5和1：2時能輕松制得顆粒。

2.5.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù) 預(yù)實驗選擇濃度分別為50%，60%，70%，80%，90%乙醇，由于浸膏粉吸濕性較強，發(fā)現(xiàn)50%，60%，70%難以制軟材，加入過少不易成團，加入稍多則太黏易板結(jié)。當(dāng)加入80%和90%乙醇后，可得到手捏成團，輕壓即散的軟材。

2.5.1.3乙醇用量 預(yù)實驗選用85%乙醇做潤濕劑，用量分別為混合粉的4%，6%，8%，10%，12%進行考察。按輔料與浸膏粉3：2的比例混勻，加入不同用量的85%乙醇，迅速混合，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用量為4%時軟材不能成團，為散粉狀; 用量為12%時，軟材呈黏稠狀; 為6%，8%，10%時，可得到手握成團，輕壓即散的軟材。

2.5.2Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實驗 在單因素考察的基礎(chǔ)上進行因素水平表設(shè)計，見表5。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，以輔料用量比、潤濕劑濃度、潤濕劑用量3個因素為自變量，以顆粒成型率、休止角、吸濕率和溶化率的總評歸一值(overall desirability，OD)[7]為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6版軟件進行三因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，實驗結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面實驗因素水平

Tab.5 Factors and levels of response surface test

水平輔料用量比(A)乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)乙醇用量(C)%-1118060238581129010

2.5.3數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 將結(jié)果采用Hassan方法[8]，分別轉(zhuǎn)化為0～1間 “歸一值”，對取值越小越好的因素(顆粒溶化性、流動性和吸濕率)，歸一值d'min=(ymax-yi)/(ymax-ymin)；取值越大越好的因素(顆粒成型率)，歸一值d'max=(yi-ymin)/(ymax-ymin)，計算出各實驗項下指標(biāo)的歸一值，再以各值求算幾何平均數(shù)，得到總評歸一值OD，OD=(d1·d2·d3·d4)1/4。得到結(jié)果后應(yīng)用Design-Expert 8.06版軟件對以上數(shù)據(jù)建立回歸模型，對回歸模型進行顯著性檢驗及方差分析，根據(jù)結(jié)果檢驗該工藝的合理性與可行性，判斷試驗結(jié)果有無參照意義，結(jié)果見表7。

表6 Box-Behnken響應(yīng)面實驗設(shè)計與指標(biāo)測定結(jié)果

表7 回歸模型方程系數(shù)及其顯著性方差分析

Tab.7 Coefficient of regression model equation and its significant variance analysis

方差來源平方和自由度均方FP模型1.10090.120119.89<0.0001A0.64010.640626.93<0.0001B7.875E-00317.875E-0037.750.0272C0.02510.02524.130.0017AB5.550E-00315.550E-0035.460.0521AC0.04510.04544.000.0003BC0.05610.05654.790.0001A20.28010.280274.31<0.0001B20.01110.01110.600.0139C20.03710.03736.520.0005殘差7.116E-00371.017E-003失擬項3.647E-00331.216E-0031.400.3648純誤差3.469E-00348.672E-004合計1.10016

A.輔料用量比；B.乙醇體積分?jǐn)?shù)；C.乙醇用量。

A.excipient ratio；B.ethanol volume fraction；C.ethanol dosage.

由表7可看出，一次項中A與C的P值均<0.01，表明它們對響應(yīng)值的影響極顯著，B的P值<0.05，對響應(yīng)值的影響顯著；交互項中A與C、B與C對響應(yīng)值的影響極顯著，A與B對響應(yīng)值的影響不顯著；二次項中A2、C2對響應(yīng)值的影響極顯著，B2對響應(yīng)值的影響顯著。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結(jié)果的影響排序A>C>B，即輔料用量比>乙醇用量>乙醇體積分?jǐn)?shù)。由方差分析可知，模型的P值<0.000 1，表明本實驗所選用的模型極顯著[9]，失擬項檢驗的P值為0.3648(不顯著)，表明擬合的回歸方程符合實際情況，用于優(yōu)選無糖型銀花感冒顆粒成型工藝條件是合理可行的。

2.5.4響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 采用Design-Expert.8.0.6版軟件分析數(shù)據(jù)，得到各因素間相互作用的響應(yīng)面和等高線圖，見圖1～3。通過軟件分析計算求得無糖型銀花感冒顆粒最佳成型工藝為：輔料用量比1：1.92，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，乙醇用量10%，結(jié)合實際情況，最終選擇輔料用量比1：2，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，乙醇用量10%為最佳成型工藝條件。

圖1 輔料用量比與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對OD值影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

Fig.1 Response surface plots and contour map for the interaction of excipient ratio and ethanol volume fraction versusODvalue

圖2 輔料用量比和乙醇用量交互作用對OD值影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

Fig.2 Response surface plots and contour map for the interaction of excipient ratio and ethanol dosage versusODvalue

2.6工藝驗證 根據(jù)篩選得到的最佳成型工藝條件，進行3批次驗證實驗，并計算OD值，實際測得平均OD值為0.916(RSD為0.35%)，與模型方程理論預(yù)測值0.928的偏差為-1.29%。顆粒符合《中華人民共和國藥典》2015年版四部 “顆粒劑”項下要求，表明該方法優(yōu)化的工藝可靠、穩(wěn)定、重復(fù)性好。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)與乙醇用量交互作用對OD值影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

Fig.3 Response surface plots and contour map for the interaction of volume fraction and dosage of ethanol versusODvalue

2.7臨界相對濕度的測定 準(zhǔn)確稱取干燥顆粒樣品2 g，共6份，分別置于放有乙酸鉀(RH22%)、氯化鎂(RH33%)、碳酸鉀(RH43%)、溴化鈉(RH60%)、氯化鈉(RH75%)、氯化鉀(RH84%)過飽溶液的干燥器中，打開稱量瓶蓋，室溫放置7 d后取出稱定質(zhì)量，計算吸濕率[10]。以相對濕度(RH%)為橫坐標(biāo)(X)，平均吸濕率(%)為縱坐標(biāo)(Y)，繪制曲線，作曲線兩端切線，切線交點對應(yīng)的橫坐標(biāo)值即為臨界相對濕度(critical relative humidity，CRH)， 結(jié)果見圖4。

Fig.4 Curves of hygroscopic rate of the granules at different RH values

由圖4可知，顆粒的CRH為54%，即制粒、分裝及貯存時，環(huán)境濕度必須控制在54%以下，以減少水分對藥物性質(zhì)及穩(wěn)定性的影響。

3 討論

中藥浸膏干燥打粉后通常具有較強的吸濕性，直接制粒有一定難度，且制備的是無糖顆粒，故應(yīng)選取適宜的無糖輔料與浸膏粉混合以降低顆粒吸濕性。本實驗結(jié)果表明，在降低吸濕性方面以乳糖和甘露醇效果最佳，但二者價格昂貴，不便于實際大生產(chǎn)的實施，所以考慮加入吸濕率稍高的糊精來降低生產(chǎn)成本。初步確定糊精、乳糖和甘露醇可作為本制劑的成型輔料后，進一步考察此3種輔料單一使用、混合使用時對顆粒性質(zhì)的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，采用混合輔料制粒的效果總體上要優(yōu)于單一輔料，這可能與浸膏粉及輔料的特性以及各輔料之間的配比有關(guān)。實驗通過考察顆粒的4項指標(biāo)對輔料進行篩選，發(fā)現(xiàn)混合輔料的最佳配比為糊精：乳糖：甘露醇=0.5：1：1.5。其中甘露醇還能作為矯味劑，可降低顆粒中添加的阿司帕坦或其他人工合成甜味劑對人體的傷害[11]，既避免顆?？嗫陔y咽，提高患者服藥順應(yīng)性，又可節(jié)約生產(chǎn)成本，因此本研究確定以3種輔料混合作為制劑的成型輔料。

對于3種輔料組成的混合輔料，其輔料之間的配比復(fù)雜多樣，考慮到采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法將其與輔料和浸膏之間的配比放在一起作為原料配比問題進行研究，會更加增大實驗的復(fù)雜性，實驗誤差也會增多，因此選擇對其進行單一考察。在考察輔料之間的配比時，共設(shè)計8組方案，較為全面合理，且能達到篩選目的。其次，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，影響顆粒性質(zhì)的因素強弱順序為：輔料用量比>乙醇體積分?jǐn)?shù)及用量>輔料間配比，表明輔料之間的配比不是影響顆粒性質(zhì)的關(guān)鍵因素，這可能與實驗所用浸膏粉的極強吸濕性有關(guān)，在單因素考察時不能完全確定合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)及用量可能也與此有聯(lián)系?？紤]到所用浸膏粉的特殊性以及本研究以顆粒成型工藝研究為側(cè)重點，課題組最終選擇將乙醇體積分?jǐn)?shù)及用量作為影響因素采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法進一步研究。結(jié)果表明，輔料與浸膏的比例、乙醇體積分?jǐn)?shù)及用量對顆粒成型性、溶化性、流動性和吸濕性的影響均較大，又由于顆粒劑考察指標(biāo)不止一個，不同指標(biāo)間互相影響，故實驗引入總評歸一值OD，將各指標(biāo)統(tǒng)一起來，基于各指標(biāo)的綜合效應(yīng)得出實驗結(jié)果，同時結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選最佳成型工藝參數(shù)，以得到最佳成型條件。

綜上所述，該工藝所制顆粒成型性較高，水分低，吸濕率低，流動性好，外觀及溶化性均符合《中華人民共和國藥典》2015年版相應(yīng)要求。與原制劑相比較，無糖型銀花感冒顆粒減少患者對糖的攝入量，擴大臨床適用患者人群，提高產(chǎn)品市場競爭力，但其是否適合工業(yè)化大生產(chǎn)以及臨床應(yīng)用還有待長期深入的研究。