糙米酒釀工藝優(yōu)化與揮發(fā)性成分分析

蘇佳佳，楊 天，佟恩杰，趙雪瑩，何程豪，楊 哪,3，徐學(xué)明,3,4，吳鳳鳳,3,

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.中糧麥芽（大連）有限公司，遼寧 大連 116000；3.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；4.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

酒釀（甜米酒）是我國(guó)備受歡迎的固態(tài)發(fā)酵食品[1]。傳統(tǒng)酒釀通常以支鏈淀粉含量較高的精白糯米為原料，經(jīng)蒸煮糊化，加入米根霉（酒曲）糖化發(fā)酵制備而成[2]。微生物的自然發(fā)酵賦予了酒釀?shì)^高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值：在適宜條件下，米根霉大量生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而分泌糖化酶、蛋白酶、酒化酶等各種酶類[3]。淀粉在糖化酶的作用下分解生成葡萄糖、麥芽糖等，這些小分子還原糖是酒釀甜味的主要來(lái)源，小部分糖會(huì)在酒化酶的作用下被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成乙醇等醇類物質(zhì)。另一方面，蛋白質(zhì)大分子在蛋白酶作用下降解為活性短肽和游離氨基酸，復(fù)雜的糖化發(fā)酵過(guò)程還產(chǎn)生了檸檬酸、葡萄糖酸、乳酸等有機(jī)酸類，使酒釀形成酸酸甜甜的口感，具有獨(dú)特風(fēng)味而深受消費(fèi)者喜愛(ài)[4]。

糙米是稻谷壟谷僅脫去最外層稻殼的米粒，是典型的全谷物食品之一[5-6]。由于保留了胚與糊粉層，其蛋白質(zhì)、膳食纖維、微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量遠(yuǎn)高于精白米[7]。糙米含有谷胱甘肽（glutathione，GSH）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、γ-谷維醇等活性功能因子，具有預(yù)防糖尿病、改善記憶、抗氧化、降血脂等作用[8]。雖然糙米營(yíng)養(yǎng)價(jià)值頗高，但直接蒸煮食用的口感粗糙，較硬難以咀嚼，且有糠味，因此難以被大眾廣泛接受，而將糙米制備成酒釀是開(kāi)發(fā)糙米產(chǎn)品的優(yōu)良途徑。研究顯示發(fā)酵能明顯提升原料米γ-氨基酸的含量，以及提升抗氧化等功能特性[9-10]。而對(duì)糙米酒釀的制備工藝的現(xiàn)有研究甚少，對(duì)于其風(fēng)味的分析更是缺乏。

本研究為開(kāi)發(fā)風(fēng)味獨(dú)特的糙米酒釀產(chǎn)品，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)結(jié)合模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)法優(yōu)化糙米酒釀的制備工藝，并采用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-OMS）聯(lián)用技術(shù)結(jié)合偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析法對(duì)糙米酒釀和糯米酒釀的揮發(fā)性成分進(jìn)行對(duì)比分析，以期進(jìn)一步探究糙米酒釀風(fēng)味組分與感官屬性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糙米（糙糯米）、糯米（糙糯米碾后的精白糯米）江南農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)有限公司；甜味型甜酒曲 安琪酵母股份有限公司；糖化酶 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸、丙三醇、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、碘、碘化鉀、硫酸、硫代硫酸鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PQX型多段可編程人工氣候箱 寧波東南儀器有限公司；TU-1900雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴 上海一恒科技有限公司；KQ-3OODE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CAR/PDMS萃取頭 上海安普科學(xué)儀器有限公司；QP2010SE/MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配DB-Wax毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm））日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

糙米→除雜→清洗→浸泡→蒸煮→冷卻→拌曲→搭窩→糖化發(fā)酵→滅酶→成品糙米酒釀

1.3.2 浸泡吸水規(guī)律的測(cè)定[11]

稱取糙米20 份，每份20 g，浸泡在含有足量蒸餾水的容器中，氣候箱中靜置（溫度25 ℃，相對(duì)濕度60%），每隔20 min取樣一次，瀝干米粒表面的水分，將米粒平鋪在吸水紙上，靜置60 s，立即稱質(zhì)量，按下式計(jì)算浸泡含水量：

式中：RW為浸泡含水量/%；M0為未浸泡米質(zhì)量20 g；W為原料米含水量/%；Mt為浸泡后第t次稱取的糙米質(zhì)量/g。

1.3.3 蒸煮糊化度測(cè)定[12]

酶水解法，在原料米蒸煮過(guò)程中，每隔5 min取樣，取樣后立即放入-40 ℃冰箱冷凍，經(jīng)冷凍干燥，樣品粉碎過(guò)100 目篩，經(jīng)索式抽提器提凈脂肪，通過(guò)酶水解法進(jìn)行糊化度測(cè)定。

1.3.4 糙米酒釀單因素試驗(yàn)

探究酒曲添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、發(fā)酵溫度（26、29、32、35、38 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（24、36、48、60、72、84 h）各因素對(duì)糙米酒釀品質(zhì)的影響，測(cè)定還原糖、總酸含量等指標(biāo)及并進(jìn)行感官評(píng)定。

1.3.5 正交優(yōu)化試驗(yàn)[13]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分析選取影響試驗(yàn)結(jié)果顯著的酒曲添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間3 個(gè)因素，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，以還原糖、總酸含量及感官評(píng)分為評(píng)定指標(biāo)，對(duì)糙米酒釀的發(fā)酵工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表 1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used for orthogonal array design

1.3.6 總酸含量測(cè)定

采用酸堿中和滴定法，取樣品酒液置于錐形瓶，加蒸餾水以一定比例稀釋，以酚酞作為指示劑，先以鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定氫氧化鈉，再用標(biāo)定后的氫氧化鈉滴定樣品，當(dāng)?shù)竭_(dá)滴定終點(diǎn)時(shí)，指示劑顯紅色，根據(jù)消耗堿液的體積計(jì)算總酸含量。

1.3.7 還原糖含量測(cè)定[14]

采用3,5-二硝基水楊酸法，顯色劑用量為2 mL，顯色時(shí)間為5 min，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各樣品吸光度。

1.3.8 模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)小組由12 名經(jīng)過(guò)感官評(píng)定分析專業(yè)培訓(xùn)且有一定評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的人員組成（6 名男性，6 名女性），于特定的感官評(píng)定室中各自獨(dú)立進(jìn)行評(píng)價(jià)。糙米酒釀的品質(zhì)評(píng)價(jià)需要綜合考慮多方面的因素，包括香氣、滋味、色澤、適口性和外觀，所有的評(píng)價(jià)指標(biāo)分為4 個(gè)等級(jí)：優(yōu)秀、良好、中等、較差，各等級(jí)對(duì)應(yīng)的評(píng)分為90、80、70、60 分。綜合感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表 2 綜合感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of rice wine

1.3.8.1 確定評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重

表 3 評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重分布Table 3 Weight distribution of sensory attributes for comprehensive evaluation

以上5 個(gè)指標(biāo)對(duì)糙米酒釀品質(zhì)都有一定的影響，綜合評(píng)價(jià)無(wú)法平等進(jìn)行比較，需根據(jù)影響的大小，采用數(shù)學(xué)方式確定各指標(biāo)的權(quán)重[15]。將各指標(biāo)之間進(jìn)行兩兩比較，如果重要程度較大則記為1，否則為0，指標(biāo)自身不進(jìn)行比較。所有指標(biāo)的權(quán)重之和等于1。評(píng)價(jià)結(jié)果如表3所示。

1.3.8.2 建立模糊綜合評(píng)價(jià)模型[16]

將評(píng)價(jià)指標(biāo)用集合A表示，則A=（a1，a2...am）=（香氣，滋味，色澤，外觀，適口性），B為等級(jí)的集合，B=（b1，b2...bn）=（優(yōu)秀，良好，中等，較差），權(quán)重的集合為U，U=（u1，u2...um）=（0.12，0.33，0.08，0.13，0.34）。根據(jù)A集、B集合建立如下模糊關(guān)系矩陣：

式中：R表示每個(gè)樣品的等級(jí)評(píng)分集合，r為每一指標(biāo)對(duì)應(yīng)的等級(jí)評(píng)分，rij＝?j（Xi）表示第i個(gè)評(píng)價(jià)隸屬于該項(xiàng)目中的j等級(jí)，i=1,2…m，j=1,2…n。每個(gè)樣品的評(píng)判結(jié)果向量轉(zhuǎn)化為矩陣U和R的乘積，設(shè)為Y，則：Y＝U×R＝（y1，y2…ym）。樣品的感官綜合評(píng)分H等于評(píng)判結(jié)果向量Y乘以各等級(jí)對(duì)應(yīng)評(píng)分，最終得出各樣品綜合評(píng)分結(jié)果。

1.3.9 糙米酒釀風(fēng)味物質(zhì)分析[17]

香氣萃取：采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）。準(zhǔn)確稱取4.00 g酒釀樣品于20 mL頂空瓶中，置于60 ℃水浴中平衡10 min。插入經(jīng)老化的萃取頭（250 ℃老化30 min）頂空吸附萃取30 min，將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口，解吸10 min。

色譜條件：采用DB-Wax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細(xì)管柱；載氣高純He（99.999%），流速1.00 mL/min。進(jìn)樣口溫度250 ℃。升溫程序：初始溫度為45 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率升至230 ℃，保持4 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度240 ℃。

嗅聞條件：樣品中的揮發(fā)性成分在潮濕的空氣推動(dòng)下以40 mL/min的速率泵入嗅吸口，由3 位經(jīng)驗(yàn)豐富的小組成員對(duì)分流部分進(jìn)行聞香分析，記錄每個(gè)揮發(fā)性香氣成分的保留時(shí)間、強(qiáng)度和香氣描述。以3 名感官評(píng)價(jià)員評(píng)定的平均值為最終結(jié)果。

1.3.10 風(fēng)味物質(zhì)與感官屬性相關(guān)性分析[18]

香氣屬性細(xì)分為酒香、米香、果香、花香、異味5 個(gè)指標(biāo)，對(duì)各樣品分別進(jìn)行感官定量分析，以GC-O-MS鑒定的發(fā)酵不同階段樣品各風(fēng)味物質(zhì)含量為X變量，各感官屬性得分為Y變量，采用PLSR研究糙米酒釀風(fēng)味物質(zhì)與感官屬性的相關(guān)性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Origin 2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)圖形化處理，采用Xcalibur軟件處理GC-MS數(shù)據(jù)，未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索并與NIST譜庫(kù)（107 k Compounds）及Wiley譜庫(kù)（320 k Compounds，version 6.0）進(jìn)行匹配，結(jié)合文獻(xiàn)查閱進(jìn)行圖譜解析。使用The Unscrambler X 10.4分析軟件進(jìn)行PLSR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳浸泡時(shí)間、蒸煮時(shí)間的確定

圖 1 浸泡時(shí)間（a）、蒸煮時(shí)間（b）對(duì)糙米酒釀品質(zhì)影響曲線圖Fig. 1 Effect of soaking time (a) and cooking time (b) on the quality of brown rice wine

浸泡吸水能夠促進(jìn)原料米蒸煮過(guò)程中的熱量傳遞，保證米粒中淀粉顆粒充分糊化，但是長(zhǎng)時(shí)間的浸泡會(huì)促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)繁殖[19]。由圖1a可看出，糙米在浸泡前期迅速吸水增重，浸泡后期增速放緩，由于纖維素、木質(zhì)素和果膠等物質(zhì)組成的糙米皮層的存在，浸泡8 h左右其含水量才趨于穩(wěn)定，飽和浸泡含水量在36.83%左右，由此可以確定糙米最佳浸泡時(shí)間為8 h。原料米蒸煮實(shí)則是淀粉顆粒吸水膨脹，晶體熔解的過(guò)程[20]，但蒸煮不僅可以促進(jìn)淀粉的糊化，同時(shí)也能對(duì)原料起到一定的滅菌作用，為后期起發(fā)酵糖化作用的米根霉快速生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造有利條件。蒸煮時(shí)間過(guò)短無(wú)法充分熟化，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致米粒軟爛，不利于拌曲搭窩發(fā)酵。由圖1b可知，隨蒸煮時(shí)間的延長(zhǎng)，糙米糊化度呈逐漸上升趨勢(shì)，但由于皮層的存在，糙米的糊化度隨時(shí)間的增速顯著慢于糯米，5～10 min增速緩慢，10～30 min時(shí)，糊化度從18.34%快速增加至94.95%，后增速放緩，逐漸趨于穩(wěn)定。為保證充分糊化，確定糙米酒釀制備所需的最佳蒸煮時(shí)間為35 min。

2.2 酒曲添加量對(duì)糙米酒釀品質(zhì)的影響

圖 2 酒曲添加量對(duì)酒釀品質(zhì)的影響Fig. 2 Effect of the amount of koji added on rice wine quality

酒曲是糙米糖化發(fā)酵成糙米酒釀的關(guān)鍵，其所含的主要菌種為米根霉，米根霉經(jīng)活化增殖，分泌各種酶類。還原糖是糖化酶作用于淀粉的產(chǎn)物，可間接表征糖化作用效果。在復(fù)雜的有氧發(fā)酵過(guò)程中，一部分糖會(huì)轉(zhuǎn)換為乳酸、延胡索酸等有機(jī)酸，是酒釀形成酸口感的主要原因[21]。由圖2可知，在酒曲添加量為0.2%～0.8%時(shí)，隨著酒曲添加量的增加，還原糖含量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，此時(shí)酒曲添加越多，產(chǎn)糖能力越強(qiáng)，糖化效果越好。當(dāng)酒曲添加量提高至0.8%～1%時(shí)，表觀還原糖含量不再增加反而下降。由圖可知，隨酒曲添加量增大，總酸始終呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，因此在0.2%～1%添加范圍內(nèi)，米根霉的產(chǎn)酸能力隨酒曲添加量增加而增強(qiáng)。酒曲添加量過(guò)少，會(huì)導(dǎo)致菌種的適應(yīng)期與對(duì)數(shù)期過(guò)長(zhǎng)，進(jìn)而增加酒釀被其他菌污染的幾率；過(guò)多的酒曲添加量雖然能夠縮短發(fā)酵期，但是菌種數(shù)量劇增會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的代謝廢物，影響酒釀品質(zhì)，故而有“曲多易壞酒”之稱，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在酒曲添加量為0.4%左右的酒釀?wù)w感官評(píng)分較高。

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)糙米酒釀品質(zhì)的影響

圖 3 發(fā)酵溫度對(duì)酒釀品質(zhì)的影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on rice wine quality

發(fā)酵溫度直接影響米根霉的生長(zhǎng)代謝情況，溫度過(guò)低或者過(guò)高都不利于糖化發(fā)酵作用[22]。由圖3可知，在26～35 ℃范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵溫度的升高，還原糖質(zhì)量濃度開(kāi)始呈上升趨勢(shì)，從204 mg/mL升高到296.4 mg/mL，表明糖化產(chǎn)還原糖的能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)35～38 ℃時(shí)，還原糖含量有所下降?？偹岷侩S著發(fā)酵溫度升高呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。感官實(shí)驗(yàn)顯示，32 ℃左右的糙米酒釀品質(zhì)較好。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)糙米酒釀品質(zhì)的影響

圖 4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒釀品質(zhì)的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on rice wine quality

如圖4所示，由于根霉菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力[23]，總酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐步增長(zhǎng)趨勢(shì)。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，還原糖生成量逐漸增多，24～36 h還原糖增速較大，后逐級(jí)放緩，72 h時(shí)達(dá)到315.1 mg/mL。72 h之后，由于微生物大量繁殖，原料米中淀粉已大部分糖化完全，此時(shí)微生物代謝消耗糖的速度已超過(guò)其糖化產(chǎn)糖的速度，故而隨發(fā)酵時(shí)間再延長(zhǎng)，表觀還原糖含量開(kāi)始下降，這與劉昭明等[24]的研究結(jié)果相似。經(jīng)感官評(píng)定分析，經(jīng)過(guò)72 h左右的恒溫發(fā)酵制備的糙米酒釀品質(zhì)較好。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表 4 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 4 Orthogonal array design with range analysis of experimental results

從表4可知，各因素對(duì)酒釀品質(zhì)的影響程度不同，各因素對(duì)還原糖影響大小順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞酒曲添加量，對(duì)總酸影響順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞酒曲添加量，對(duì)感官評(píng)分影響順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞酒曲添加量，這與鄭煥芹等[25]研究的糯米酒釀品質(zhì)影響因素排序一致。通過(guò)模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)定結(jié)合還原糖含量、總酸值的綜合衡量，最終確定糙米酒釀最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)組合為A2B3C1。由此可知：糙米經(jīng)過(guò)8 h的浸泡，蒸煮35 min，冷卻至室溫，添加0.4%的酒曲，搭窩，在35 ℃的發(fā)酵溫度下，恒溫發(fā)酵60 h制備得到的糙米酒釀最佳。

2.6 糙米與糯米酒釀風(fēng)味對(duì)比分析

圖 5 糯米酒釀（a）和糙米酒釀（b）GC-MS總離子流圖圖Fig. 5 Total ion current chromatograms of glutinous rice wine (a) and brown rice wine (b)

表 5 糙米酒釀和糯米酒釀中的揮發(fā)性成分GS-MS鑒定結(jié)果Table 5 GS-MS identification of volatile components in brown rice wine and glutinous rice wine

續(xù)表5

對(duì)酒釀復(fù)雜風(fēng)味的詮釋需要風(fēng)味化合物分子層面的數(shù)據(jù)[26]。由圖5、表5可知，傳統(tǒng)的糯米酒釀的總風(fēng)味物質(zhì)36 種，且以醇、酯類為主，這與高瑩瑩等[27]的研究結(jié)果相吻合。醇類物質(zhì)有14 種，乙醇相對(duì)含量較高，達(dá)到了19.13%，其次為異戊醇，相對(duì)含量為14.05%，然后是己醇，相對(duì)含量為3.33%。酯類物質(zhì)共6 種，最高的酯類物質(zhì)棕櫚酸乙酯，相對(duì)含量為3.95%。醛類物質(zhì)7 種，含量最高的是糠醛，相對(duì)含量為1.70%。酸類物質(zhì)3 種，己酸含量最高，相對(duì)含量為0.13%。酮類物質(zhì)4 種，含量最高的是二羥基丙酮，相對(duì)含量為2.04%。呋喃類1 種，為2-正戊基呋喃。萜烯類1 種，為β-石竹烯。

糙米酒釀的總風(fēng)味物質(zhì)47 種，同樣以醇、酯類為主，但比糯米酒釀的風(fēng)味要更加豐富。其中醇類物質(zhì)22 種，乙醇相對(duì)含量較高，達(dá)到了28.66%，其次為異戊醇，相對(duì)含量為12.48%，之后為己醇，相對(duì)含量為5.43%。酯類物質(zhì)共10 種，最高的酯類物質(zhì)為肉豆蔻酸乙酯，相對(duì)含量為1.12%。醛類物質(zhì)5 種，含量最高的是己醛，相對(duì)含量為0.18%。酸類物質(zhì)3 種，異戊酸含量最高，相對(duì)含量為0.22%。酮類物質(zhì)5 種，含量最高的是甲基庚烯酮，相對(duì)含量為0.47%。呋喃類1 種，為2-正戊基呋喃。萜烯類1 種，為β-石竹烯。

圖 6 糙米酒釀與糯米酒釀香風(fēng)味屬性感官定量分析（A）及風(fēng)味化合物種類分布（B）Fig. 6 Quantitative analysis of sensory flavor properties (A) and distribution (B) of flavor compounds

GC-MS從分子水平對(duì)兩者的風(fēng)味進(jìn)行了分析對(duì)比，宏觀上的風(fēng)味感官分析則更為直觀。由圖6可知，兩者的風(fēng)味整體分布相似，糙米酒釀與糯米酒釀的米香味與酒香味均較為突出，花香與果香較弱，兩者均無(wú)明顯異味。酒香屬性上，糙米酒釀強(qiáng)于糯米酒釀，可能是糙米酒釀中醇類物質(zhì)比糯米酒釀多所致。感官定量分析得到糙米酒釀的豐富度強(qiáng)于糯米酒釀，這與GC-MS鑒定所得糙米酒釀的總風(fēng)味物質(zhì)多于糯米酒釀的結(jié)果相照應(yīng)。

2.7 糙米與糯米酒釀關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)分析

氣味是影響酒釀品質(zhì)的重要因素之一，宜人的氣味可以激發(fā)食欲，為進(jìn)一步探究各種揮發(fā)性化合物對(duì)酒釀氣味的貢獻(xiàn)程度[28]，實(shí)驗(yàn)用HS-SPME法快速富集樣品中的風(fēng)味物質(zhì)，采用分流進(jìn)樣法，通過(guò)GC-O嗅聞辨別結(jié)合GC-MS定量分析，得到對(duì)整體風(fēng)味有貢獻(xiàn)的氣味活性物質(zhì)。

表 6 揮發(fā)性成分對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)程度GC-O-MS鑒定結(jié)果Table 6 GS-O-MS identification of the contribution of volatile components to the flavor of rice wine

由表6可知，糯米酒釀能被嗅聞鑒定的化合物有19 種，而糙米酒釀能被嗅聞鑒定的揮發(fā)性化合物則有29 種，因此糙米酒釀的氣味豐富度比傳統(tǒng)糯米酒釀要高。隨著分流稀釋倍數(shù)增加，能被嗅聞識(shí)別的風(fēng)味化合物逐漸減少，在糙米酒釀進(jìn)樣氣體量分流稀釋到27 倍時(shí)，乙醇、丁酸乙酯、2-戊基呋喃、甲基庚烯酮、己醇、蘑菇醇6 種風(fēng)味化合物仍舊能被嗅聞到。由此可知，乙醇、丁酸乙酯、2-戊基呋喃、甲基庚烯酮、己醇、蘑菇醇等對(duì)糙米酒釀風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，是糙米酒釀的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。對(duì)照組糯米酒釀風(fēng)味主要貢獻(xiàn)的化合物為乙醇、丁酸乙酯、2-戊基呋喃、己醇和異戊醇。進(jìn)一步可知，乙醇、丁酸乙酯、2-戊基呋喃、己醇為糙米酒釀和糯米酒釀共有的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。

2.8 發(fā)酵各階段糙米酒釀的風(fēng)味變化分析

圖 7 發(fā)酵過(guò)程中5 種香氣屬性感官定量分析（A）及風(fēng)味化合物種類分布（B）Fig. 7 Sensory quantitative analysis of five aroma attributes of rice wine during fermentation (A) and distribution of flavor compounds (B)

對(duì)糙米酒釀發(fā)酵不同時(shí)段氣味屬性進(jìn)行定量感官分析，并對(duì)GC-O鑒定的發(fā)酵各階段有風(fēng)味貢獻(xiàn)的化合物進(jìn)行分類匯總。由圖7可知，發(fā)酵全過(guò)程中無(wú)明顯異味，發(fā)酵初期，米香最為明顯，酒香、果香、花香均最弱，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酒香逐漸增強(qiáng)突出，發(fā)酵成熟后的花香與果香味明顯強(qiáng)于發(fā)酵初期，而米香則隨著發(fā)酵進(jìn)程呈減弱趨勢(shì)。從整體上看，醇、酯、醛、酸類等風(fēng)味化合物隨糙米酒釀發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)種類逐漸豐富。

2.9 風(fēng)味物質(zhì)與感官屬性相關(guān)性分析

GC-O是一種從復(fù)雜混合物中鑒別氣味成分的有用方法，但它沒(méi)有顯示出風(fēng)味物質(zhì)與香氣的相關(guān)性[29]。因此本研究采用PLSR對(duì)發(fā)酵不同時(shí)間糙米酒釀GC-O-MS檢測(cè)出的34 種揮發(fā)性組分和5 種感官屬性進(jìn)行相關(guān)性分析[30]。

優(yōu)化的PLSR模型包含2 個(gè)主成分，由圖8可知，兩個(gè)主成分對(duì)X變量解釋方差為87%，對(duì)Y變量的解釋方差為91%，大部分變量均位于r2為0.5和1.0的橢圓之間，說(shuō)明該模型能很好地解釋糙米酒釀的酒香、花香、果香、米香、異味與其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性[31]。

圖 8 糙米酒釀香氣屬性與風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性分析載荷圖Fig. 8 Loading plot showing the correlation between the aroma attributes and flavor substances of brown rice wine

由圖8可知，大部分風(fēng)味物質(zhì)分布在橢圓左右兩側(cè)，丁酸、3-羥基己酸乙酯等個(gè)別風(fēng)味物質(zhì)位于r2為0.5橢圓以內(nèi)，表明不是所有的揮發(fā)性組分都對(duì)糙米酒釀的氣味有貢獻(xiàn)作用。乙醇、丁酸乙酯、D-香茅醇、肉豆蔻酸乙酯、異戊酸、苯乙醇等21 種風(fēng)味物質(zhì)與酒香、花香、果香同位于載荷圖的左側(cè)，說(shuō)明這21 種風(fēng)味物質(zhì)與這3 個(gè)感官屬性呈正相關(guān)。PLSR模型性質(zhì)表明分布越近，相關(guān)性越強(qiáng)[32]，圖8顯示乙醇、己醛、天竺葵醇、D-香茅醇、戊酸乙酯等與酒香、果香屬性分布較近，由此可判定乙醇、己醛、天竺葵醇、D-香茅醇、戊酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)含量的增加是引起糙米酒釀的酒香、果香風(fēng)味增強(qiáng)的主要因素；與花香屬性相關(guān)性較強(qiáng)的風(fēng)味物質(zhì)是丁酸乙酯，通過(guò)改善丁酸乙酯的含量可以增強(qiáng)酒釀花香感官特征。己醇、2-戊基呋喃、苯乙醇、香葉基丙酮、壬醛等11 種風(fēng)味物質(zhì)和米香、異味屬性同位于荷載圖的右側(cè)，呈正相關(guān)；甲基庚烯酮、2-戊基呋喃、蘑菇醇、壬醛等分布在米香屬性周圍，表明了在發(fā)酵過(guò)程中，甲基庚烯酮、2-戊基呋喃等風(fēng)味物質(zhì)含減少是導(dǎo)致酒釀的米香逐漸減弱的主要因素。異味屬性周圍的風(fēng)味物質(zhì)不多，只有β-石竹烯對(duì)異味有一定的貢獻(xiàn)作用，整體香氣無(wú)明顯異味。

3 結(jié) 論

本研究?jī)?yōu)化了糙米酒釀的制備工藝，實(shí)驗(yàn)得出：經(jīng)過(guò)8 h浸泡，蒸煮35 min，添加0.4%的酒曲，在35 ℃恒溫發(fā)酵60 h制備得到的糙米酒釀最佳。與傳統(tǒng)糯米酒釀相對(duì)比，糙米酒釀的風(fēng)味物質(zhì)種類更加豐富。經(jīng)優(yōu)化工藝制備得到的糙米酒釀的總風(fēng)味物質(zhì)有47 種，能被GC-O鑒定的揮發(fā)性化合物有29 種，其中乙醇、丁酸乙酯、2-戊基呋喃、己醇、甲基庚烯酮、蘑菇醇等在分流稀釋27 倍條件下仍能被嗅聞識(shí)別，為糙米酒釀主體香氣成分。進(jìn)一步的PLSR分析結(jié)果顯示乙醇、丁酸乙酯等風(fēng)味組分與糙米酒釀的酒香、果香、花香呈較強(qiáng)的正相關(guān)，是糙米酒釀酒香、果香、花香屬性的主體呈香物質(zhì)；2-戊基呋喃、甲基庚烯酮、己醇、蘑菇醇等與米香呈較強(qiáng)的正相關(guān)，是糙米酒釀米香屬性的主體呈香物質(zhì)。