王燦 潘海亮 梁泉喜 王永澤 王金華

摘要??[目的]通過mglB基因敲除進(jìn)一步降低混合糖發(fā)酵時常存在的葡萄糖效應(yīng)，提高水稻秸稈水解液發(fā)酵L-丙氨酸的效率。?[方法]以大腸桿菌ptsG基因缺陷菌株JH-B3為出發(fā)菌，利用RED同源重組技術(shù)敲除葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因mglB，構(gòu)建ptsG和mglB雙缺陷菌株JH-B6，分別以60?g/L葡萄糖、30?g/L木糖和水稻秸稈水解液為碳源進(jìn)行發(fā)酵，驗證mglB基因缺失對菌株利用葡萄糖、木糖和混合糖能力的影響。[結(jié)果]以60?g/L葡萄糖發(fā)酵時，JH-B6利用葡萄糖速率較JH-B3下降了19.9%;以30?g/L木糖發(fā)酵時，JH-B6利用木糖速率較JH-B3增加了23.5%;以水稻秸稈水解液發(fā)酵時，JH-B3發(fā)酵周期和糖酸轉(zhuǎn)化率分別為128?h和89.5%，JH-B6發(fā)酵周期為88?h，較JH-B3縮短了31.3%，糖酸轉(zhuǎn)化率為93.9%，較JH-B3提高了4.9%。[結(jié)論]?雙基因缺陷型菌株JH-B6在ptsG基因缺陷菌株JH-B3的基礎(chǔ)上缺失mglB基因，進(jìn)一步降低了葡萄糖效應(yīng)，提高了水稻秸稈水解液發(fā)酵L-丙氨酸的效率。

關(guān)鍵詞?水稻秸稈;mglB基因;葡萄糖效應(yīng);L-丙氨酸;發(fā)酵

中圖分類號?S182文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A文章編號?0517-6611（2020）07-0113-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.033

The?Knockout?of?mglB?Gene?of?Escherichia?coli?Engineering?Strain?and?Lalanine?Fermentation?with?Rice?Straw?Hydrolysate

WANG?Can1，?PAN?Hailiang1，?LIANG?Quanxi2?et?al

（1.?Key?Laboratory?of?Fermentation?Engineering?of?Ministry?of?Education，Hubei?University?of?Technology，Wuhan，Hubei?430068;2.?Huakang?Mengzhiyuan?Biotechnology?Co.，Ltd.，Binzhou，Shandong?256600）

Abstract?[Objective]The?knockout?of?the?mglB?gene?was?preformed?to?reduce?the?glucose?effect?which?often?presents?in?the?mixed?sugar?fermentation，?which?might?improve?the?efficiency?of?Lalanine?fermenting?using?the?rice?straw?hydrolysate.?[Method]Using?the?E.?coli?ptsG?genedeficient?strain?JHB3?as?the?starting?strain，?the?glucose?transport?gene?mglB?was?knocked?out?by?RED?homologous?recombination?technology?to?construct?ptsG?and?mglB?doubledeficient?strain?JHB6，?respectively，?with?60?g/L?glucose?and?30?g/L?xylose?and?rice?straw?hydrolysate?was?fermented?as?a?carbon?source?respectively?to?verify?the?effect?of?the?mglB?gene?deletion?on?the?ability?of?the?strain?to?utilize?glucose，?xylose?and?mixed?sugar.?[Result]When?fermented?with?60?g/L?glucose，?the?glucose?consumption?of?JHB6?decreased?by?19.9%?compared?with?JHB3.In?the?case?of?fermented?with?30?g/L?xylose，?the?xylose?consumption?of?JHB6?increased?by?23.5%?compared?with?JHB3.?When?fermented?with?rice?straw?hydrolysate，?the?fermentation?time?and?sugar?conversion?of?JHB3?were?128?h?and?89.5%，?respectively.?The?fermentation?time?of?JHB6?was?88?h，?which?was?31.3%?shorter?than?JHB3，?and?the?sugar?conversion?of?JHB6?was?93.9%，?an?increase?of?4.9%?over?JHB3.?[Conclusion]The?deletion?of?mglB?gene?on?the?basis?of?ptsG?genedeficient?strain?JHB3?further?reduced?the?glucose?effect?and?improved?the?fermentation?efficiency?of?Lalanine?in?rice?straw?hydrolysate.

Key?words?Rice?straw;mglB?gene;Glucose?effect;Lalanine;Fermentation

基金項目?國家“十二五”支撐計劃（2012BAD27B03）。

作者簡介?王燦（1991—），男，河南駐馬店人，碩士，從事微生物工業(yè)發(fā)酵研究。通信作者，教授，從事有機(jī)酸工業(yè)發(fā)酵研究。

收稿日期?2019-09-23

我國是農(nóng)業(yè)大國，每年都有大量的水稻秸稈產(chǎn)出。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，2018年我國僅可收集的秸稈資源量高達(dá)約7億t，其中水稻秸稈約2.1億t[1]。作為可再生的優(yōu)質(zhì)生物能源，過去少數(shù)秸稈用于燒火做飯以及喂養(yǎng)牲口，而大多數(shù)秸稈則直接被焚燒，不僅是能源的浪費(fèi)，而且對環(huán)境造成了嚴(yán)重污染。近年來，國家一系列關(guān)于農(nóng)作物秸稈綜合利用的政策出臺，推進(jìn)了農(nóng)作物秸稈利用的多途徑化、合理化和效益化?，F(xiàn)在農(nóng)作物秸稈的再利用途徑主要有以下幾方面：①用于直接粉碎還田使農(nóng)田更加肥沃;②用于制作草簾、草繩等日用品或工藝品;③用作多種食用菌的栽培基質(zhì);④用于制作建材基質(zhì);⑤代替煤礦進(jìn)行發(fā)電以及用于腐解生成沼氣，從而優(yōu)化能源結(jié)構(gòu);⑥作為生物原料用于微生物發(fā)酵等行業(yè)從而產(chǎn)出其他工業(yè)產(chǎn)品，如氨基酸、維生素、乳酸等[2]。目前前5種秸稈利用途徑已經(jīng)形成初步規(guī)模的工業(yè)化或商業(yè)化，而作為生物原料用于微生物發(fā)酵尚處于研究階段。

L-丙氨酸是人體血液中含量最高的一種非必需氨基酸，在食品、醫(yī)藥和日化用品等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用[3]，市場對丙氨酸具有極大的需求量。目前丙氨酸的生產(chǎn)主要是通過微生物發(fā)酵，其生產(chǎn)原料是以小麥或玉米等糧食制成的葡萄糖，這不僅消耗大量經(jīng)濟(jì)糧食，而且形成了“與人爭糧”的不利局面。水稻秸稈中含有大量能降解成葡萄糖或木糖的纖維素和半纖維素，而如何利用水稻秸稈代替小麥或玉米等糧食進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)丙氨酸，其中關(guān)鍵技術(shù)在于如何有效處理秸稈使其充分降解成葡萄糖和木糖等還原糖，以及如何解除微生物在利用秸稈水解液過程還原糖中的葡萄糖對其他糖的分解代謝阻遏效應(yīng)，即葡萄糖效應(yīng)[4]。對于解除微生物在利用秸稈水解液的過程中存在的葡萄糖效應(yīng)，一般通過基因工程技術(shù)對微生物進(jìn)行改造。通過基因工程技術(shù)敲除大腸桿菌磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphoenolpyruvate：carbohydrate?phosphotransferase?system，PTS）[5]中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因（ptsG）[6]以降低葡萄糖效應(yīng)的研究已取得了一定的成果，在此基礎(chǔ)上再敲除半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中也能轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的D-半乳糖/D-葡萄糖結(jié)合蛋白基因（mglB）[7]，從而進(jìn)一步降低葡萄糖效應(yīng)的研究也已經(jīng)展開，如江吉雄[8]通過敲除mglB基因，降低了混合糖發(fā)酵D-乳酸中的葡萄糖效應(yīng)，使發(fā)酵周期縮短了40%左右，轉(zhuǎn)化率提高了2.3%;許瓊丹等[9]通過敲除mglB基因，也降低了混合糖發(fā)酵乙醇中的葡萄糖效應(yīng)，使發(fā)酵周期縮短了36%左右，轉(zhuǎn)化率提高了5.8%。

該研究以本實驗室構(gòu)建的ptsG基因缺陷菌株JH-B3為出發(fā)菌株，擬通過Red同源重組技術(shù)敲除mglB基因，從而構(gòu)建?ptsG/mglB基因雙缺陷菌株，使菌株利用水稻秸稈水解液發(fā)酵中的葡萄糖效應(yīng)進(jìn)一步降低，以縮短菌株利用水稻秸稈水解液發(fā)酵丙氨酸的發(fā)酵周期，進(jìn)一步提高水稻秸稈的利用率和丙氨酸發(fā)酵效率，為實現(xiàn)以廉價的水稻秸稈工業(yè)化生產(chǎn)L-丙氨酸提供支持。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌株與質(zhì)粒。

出發(fā)菌株為大腸桿菌工程菌ptsG基因缺陷菌株JH-B3（ΔfrdBC，ΔadhE，Δpta，ΔldhA，ΔptsG，ΔpflB∷alaD），此菌株能同時利用葡萄糖和木糖發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸，由本實驗室前期構(gòu)建并保存。菌株JH-B6是通過Red同源重組技術(shù)在工程菌JH-B3基礎(chǔ)上獲得的ptsG/mglB基因雙缺陷菌株。質(zhì)粒pKD4（包含F(xiàn)RT-kan-FRT閱讀框和Amp抗性基因）和質(zhì)粒pKD46（包含編碼Red重組系統(tǒng)的基因和Amp抗性基因）由本實驗室保存。

1.1.2?水稻秸稈。

水稻秸稈來自武漢市江夏區(qū)農(nóng)田，其中纖維素34.7%、半纖維素26.1%、木質(zhì)素16.7%，測定方法參考文獻(xiàn)[10]。

1.1.3?主要試劑與儀器。

主要試劑：CaCl2·2H2O（AR）、L-阿拉伯糖（AR）、醋酸鈉（AR）、卡那霉素、氨芐青霉素、10%磷酸溶液、1.3%氫氧化鈉溶液、纖維素酶;主要儀器：電泳儀、凝膠自動成像儀、PCR儀、電轉(zhuǎn)儀、高效液相色譜儀、賽得利斯發(fā)酵罐、生物傳感儀。

1.1.4?培養(yǎng)基。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10?g/L、氯化鈉5?g/L、酵母粉5?g/L、葡萄糖20?g/L、瓊脂粉20?g/L（固體）。

卡那抗性篩選培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基中加入50?mg/L氨芐青霉素。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中的糖換為20?g/L阿拉伯糖。

種子培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基，20?g/L葡萄糖。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10?g/L、氯化鈉5?g/L、酵母粉5?g/L、碳源為水稻秸稈水解液。

1.2?方法

1.2.1?水稻秸稈預(yù)處理。

將水稻秸稈經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過80目篩，60?℃下烘干至恒重，儲存?zhèn)溆?。稱取100?g粉碎后的干秸稈，按質(zhì)量體積比1∶10加入1.3%氫氧化鈉溶液，混合均勻后55?℃處理30?h[11]，離心保留上清液并用85%磷酸回調(diào)pH至6.0，殘渣用水洗至中性后烘干。將烘干后的殘渣按質(zhì)量體積比1∶9加入10%磷酸溶液[12]，混合均勻后，放入高壓蒸汽滅菌鍋，125?℃下處理90?min，然后50?℃下再處理20?min。離心后的上清液用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH至6.0后再過濾，濾液回調(diào)pH至6.0。將分別經(jīng)過氫氧化鈉和磷酸溶液處理所得的處理液混合均勻后備用。

1.2.2?秸稈預(yù)處理液的纖維素酶處理。

將“1.2.1”中所得的水稻秸稈預(yù)處理液按每10?g秸稈加入30?FPU酶量的纖維素酶，在pH=6.0、50?℃和200?r/min的條件下進(jìn)行纖維素酶水解反應(yīng)60?h[11]。最后將水解液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至體積為0.5?L，檢測其中還原糖、葡萄糖和木糖的含量。

1.2.3?引物的設(shè)計。

根據(jù)mglB基因序列設(shè)計敲除引物P1和P2，如表1所示，該對引物5′端45?bp片段與mglB基因序列同源，表中下劃線序列與質(zhì)粒pKD4上FRT-kan-FRT閱讀框序列同源，又根據(jù)擴(kuò)增引物P1、P2設(shè)計了驗證引物P3、P4，驗證引物序列與擴(kuò)增引物上mglB兩側(cè)各20?bp序列相同。

1.2.4?大腸桿菌工程菌E.coli?JH-B6菌株構(gòu)建。

以pKD4質(zhì)粒為模板，用擴(kuò)增引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得帶有Kan抗性基因的敲除片段，用乙醇沉淀和切膠回收以純化基因敲除片段。PCR反應(yīng)條件：

95?℃3?min預(yù)變性;95?℃30?s，50?℃30?s，72?℃2?min，循環(huán)30次;72?℃5?min延伸;4?℃，∞。

用CaCl2法[13]將pKD46轉(zhuǎn)化到E.coli?JH-B3細(xì)胞中，獲得E.coli?JH-B3/pKD46單菌落，再將此單菌落轉(zhuǎn)接至含2%阿拉伯糖的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30?℃培養(yǎng)至其菌液OD600=0.4左右時，用無菌去離子水洗滌3次，棄去上清液，再用200?μL超純水將E.coli?JH-B3/pKD46的菌體重懸，取80?μL的重懸菌液和10?μL基因敲除產(chǎn)物混合進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)電壓為2.5?kV，時間為4.9?ms。隨后將電擊后的菌液立即轉(zhuǎn)移LB液體培養(yǎng)基中，于37?℃、200?r/min條件下復(fù)蘇培養(yǎng)1?h，涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，于37?℃下恒溫培養(yǎng)出單菌落。再挑取單菌落為模板，用驗證引物P3、P4進(jìn)行PCR驗證（反應(yīng)條件：95?℃3?min預(yù)變性;95?℃30?s，50?℃30?s，72?℃2?min，循環(huán)30次;72?℃5?min延伸;4?℃，∞）。若成功轉(zhuǎn)化，命名為E.coli?JH-B6。挑取E.coli?JH-B6菌株在卡那霉素LB固體培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)8代以上，進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵試驗。

1.2.5?發(fā)酵試驗。

1.2.5.1

單糖發(fā)酵。參照“1.2.2”中所測得的水稻秸稈水解液中葡萄糖和木糖的濃度，按兩者的濃度比例設(shè)置單糖發(fā)酵試驗的初始葡萄糖濃度和初始木糖濃度，比較JH-B3和JH-B6發(fā)酵情況，以探究mglB基因敲除對單糖發(fā)酵L-丙氨酸的影響。

1.2.5.2?水稻秸稈水解液發(fā)酵。以蒸發(fā)濃縮至0.9?L的水稻秸稈水解液為發(fā)酵碳源，比較JH-B3和JH-B6的發(fā)酵情況，以探究mglB基因敲除對水稻秸稈水解液發(fā)酵L-丙氨酸的影響。

每次發(fā)酵試驗進(jìn)行3次平行試驗，發(fā)酵體積0.5?L，接種量1%。發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速200?r/min，溫度37?℃，pH?6.8，中和劑為26%的氨水。每隔固定時長取樣并檢測菌體OD600、糖含量和L-丙氨酸含量，并對比2種菌種利用糖的能力及產(chǎn)L-丙氨酸能力。

1.2.6?分析檢測。

菌體生物量：722型可見分光光度計;還原糖：DNS法[14];葡萄糖：生物傳感儀;

木糖：高效液相色譜法，色譜柱為Bio-Rad?HPX87H，流動相為4?mmol/L?H2SO4，流速為0.5?mL/min，柱溫為40?℃，示差檢測器[15]。

L-丙氨酸：高效液相色譜法，色譜柱為依利特C18柱（ODS-BP?5?μm，4.6?mm×250?mm），流動相為0.05?mol/L?Na2HPO4，用磷酸調(diào)節(jié)pH至6.5，CH3OH和Na2HPO4溶液體積比為1∶9;流速為0.80?mL/min，溫度為30?℃，進(jìn)樣量為5?μL，紫外檢測器，檢測波長為210?nm[16]。

阿拉伯糖：高效液相色譜法，色譜柱為Bio-Rad?Aminex?HPX-87H離子交換柱（300?mm×7.8?mm），流動相為5?mmol/L?H2SO4，流速為0.6?mL/min，柱溫為45?℃，進(jìn)樣量為10?μL，RID-20A型示差折光檢測器[17]。

2?結(jié)果與分析

2.1?水稻秸稈水解液糖濃度檢測結(jié)果

100?g水稻秸稈的水解液蒸發(fā)濃縮至0.5?L后，其中還原糖、葡萄糖和木糖的含量分別為104.8、66.2、32.6?g/L，其還原糖的產(chǎn)率為0.524?g/g（即每1?g水稻秸稈產(chǎn)出還原糖0.524?g），達(dá)到理論值的86%左右，大幅高于一次預(yù)處理加酶水解的50%～70%。由此可知，水稻秸稈經(jīng)過磷酸和氫氧化鈉兩次預(yù)處理后再酶解可得到更多的還原糖，這是因為稻草秸稈中纖維素含量比半纖維素高，不利于稻草秸稈的糖化，且半纖維素更容易降解[18]，所以第一步氫氧化鈉預(yù)處理通常得到較多的木糖，而葡萄糖很少。將氫氧化鈉預(yù)處理固液分離后的殘渣再用磷酸進(jìn)行預(yù)處理，提高處理溫度和壓強(qiáng)，使纖維素進(jìn)一步降解從而得到較多的葡萄糖，同時避免了木糖在第二步酸解中被降解成糠醛和乙酸等副產(chǎn)物。

2.2?mglB基因缺陷菌株的鑒定

以JH-B3菌株作為對照，以驗證引物P3、P4對JH-B6菌株進(jìn)行PCR驗證。以擴(kuò)增引物P1、P2經(jīng)PCR得到的含卡那霉素抗性基因的敲除片段大小約為1?550?bp，設(shè)計的驗證引物P3、P4（均20?bp）與基因敲除片段上P1、P2兩端的20?bp序列相同，mglB基因自身長度約999?bp。

因此，用驗證引物P3、P4經(jīng)PCR擴(kuò)增出的片段應(yīng)為1?550?bp，與mglB自身長度相差約551?bp。試驗結(jié)果如圖1所示，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增片段與預(yù)期片段大小相符，說明mglB基因成功敲除。

2.3?2種菌株利用葡萄糖和木糖能力對比

JH-B3和JH-B6分別以60?g/L葡萄糖和30?g/L木糖為碳源發(fā)酵L-丙氨酸時，其發(fā)酵情況見圖2。由圖2A可知，當(dāng)2種菌株以60?g/L葡萄糖為碳源發(fā)酵L-丙氨酸時，在生長方面，JH-B3和JH-B6能達(dá)到最大OD600，分別為7.02和7.84;在利用葡萄糖方面，JH-B3平均耗糖率為1.86?g/（L·h），而JH-B6平均耗糖率為1.49?g/（L·h），較JH-B3降低了19.9%;在產(chǎn)L-丙氨酸方面，JH-B3在32?h發(fā)酵結(jié)束，最終L-丙氨酸濃度為52.2?g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為87.9%，而JH-B6在40?h發(fā)酵結(jié)束，最終L-丙氨酸濃度為51.9?g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為87.1%，均略低于JH-B3。

由圖2B可知，當(dāng)2種菌株以30?g/L木糖為唯一碳源發(fā)酵L-丙氨酸時，在菌株生長方面，JH-B3和JH-B6能達(dá)到最大OD600，分別為6.36和7.53，且JB-B6的OD600始終大于JB-B3;在利用木糖方面，JH-B3的平均耗糖速率為0.34?g/（L·h），而JH-B6平均耗糖率為0.42?g/（L·h），較JH-B3增加了23.5%;在產(chǎn)L-丙氨酸方面，JH-B3在88?h發(fā)酵結(jié)束，最終L-丙氨酸濃度為25.9?g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為86.3%，而JH-B6在72?h發(fā)酵結(jié)束，最終L-丙氨酸濃度為27.2?g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為90.6%，均略高于JH-B3。

以上結(jié)果表明，在利用葡萄糖時，JH-B6在生長方面優(yōu)于JH-B3，但糖酸轉(zhuǎn)化率略低于JH-B3，其原因可能是，在發(fā)酵中后期JH-B6攝取的葡萄糖更多地用于菌株生長，但JH-B6利用葡萄糖能力卻低于JH-B3;在利用木糖時，JH-B6在生長方面和利用木糖的能力均優(yōu)于JH-B3。綜上所述，mglB基因的敲除確實能有效降低菌株攝取利用葡萄糖的能力且有利于菌株生長;同時mglB基因的敲除也增強(qiáng)了菌株對木糖攝取利用的能力。

2.4?2種菌株利用水稻秸稈水解液能力對比

以水稻秸稈水解液作為發(fā)酵碳源，JH-B3和JH-B6的菌體生長情況、耗糖情況及L-丙氨酸產(chǎn)量見圖3。由圖3A可知，在菌體生長方面，JH-B3和JH-B6能達(dá)到最大OD600，分別為6.92和7.84;在40?h之前，JH-B3的生物量均略大于JH-B6的生物量，在40?h之后，JH-B6的生物量反超JH-B3。

圖3?菌株JH-B3和JH-B6在混合糖中的生長曲線（A）、耗糖（B）及L-丙氨酸產(chǎn)量（C）

Fig.3?Growth?curves（A），sugar?consumption（B）and?Lalanine?production（C）of?strain?JHB3?and?JHB6?in?mixed?sugar

由圖3B可知，在耗葡萄糖方面，JH-B3在40?h時耗盡葡萄糖，葡萄糖平均消耗速率為1.65?g/（L·h），而JH-B6在52?h時耗盡葡萄糖，平均速率為1.27?g/（L·h），較JH-B3下降了23.0%。在耗木糖方面，JH-B3在128?h耗盡木糖，平均消耗速率為0.25?g/（L·h），JH-B6在88?h耗盡木糖，平均消耗速率為0.37?g/（L·h），較JH-B3提高了48.0%。在總糖還原糖方面，JH-B3和JH-B6均是在發(fā)酵前期以消耗葡萄糖為主，速度較快，當(dāng)葡萄糖被利用完后，兩者均是以消耗木糖為主，速度較慢;JH-B3和JH-B6分別在128、88?h時基本耗盡還原糖，即JH-B6的發(fā)酵周期較JH-B3縮短了31.3%;JH-B3平均耗糖速率為0.82?g/（L·h），JH-B6平均耗糖速率為1.19?g/（L·h），相比于JH-B3增加了45.1%。

由圖3C可知，在L-丙氨酸產(chǎn)量方面，JH-B3和JH-B6均是前期產(chǎn)L-丙氨酸較快，當(dāng)葡萄糖消耗完后產(chǎn)L-丙氨酸較慢，與還原糖的消耗情況保持一致。菌株JH-B3和JH-B6最終L-丙氨酸產(chǎn)量分別為93.8、98.4?g/L，平均生產(chǎn)強(qiáng)度分別為0.73、1.12?g/（L·h），轉(zhuǎn)化率分別為89.5%和93.9%，相比JH-B3，JH-B6的平均生產(chǎn)強(qiáng)度增加了53.4%，轉(zhuǎn)化率提高了4.9%。

以上結(jié)果表明，在水稻秸稈水解液中，JH-B6在菌體生長上強(qiáng)于JH-B3;在利用糖方面，雖然JH-B6攝取利用葡萄糖的能力低于JH-B3，但其攝取利用木糖的能力遠(yuǎn)強(qiáng)于JH-B3，以致于在整體利用還原糖的能力上反而強(qiáng)于JH-B3，從而使JH-B6的發(fā)酵速率更快、發(fā)酵周期更短;在產(chǎn)L-丙氨酸方面，JH-B6的L-丙氨酸產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化率均高于JH-B3。綜上所述，mglB基因敲除，有利于菌株在水稻秸稈水解液中生長和發(fā)酵丙氨酸，并且降低葡萄糖對木糖等其他碳源的分解代謝阻遏效應(yīng)，從而使發(fā)酵周期大幅縮短，提高了丙氨酸產(chǎn)率和發(fā)酵效率。

3?結(jié)論

水稻秸稈具有結(jié)構(gòu)緊密的特點，其中主要成分纖維素具有高結(jié)晶度和難溶性等特點，使其與催化劑或酶的接觸困難，不易被水解，而半纖維素比纖維素容易降解，通常一次預(yù)處理難以使纖維素充分降解，從而還原糖的產(chǎn)率較低。若對一次預(yù)處理后的殘渣通過提高處理時間、溫度等條件進(jìn)行二次處理，理論上可以使水稻秸稈進(jìn)一步降解，提高還原糖產(chǎn)率，從而提高丙氨酸發(fā)酵效率。

此次研究通過對水稻秸稈進(jìn)行磷酸和氫氧化鈉二次處理再結(jié)合纖維素酶水解，還原糖的產(chǎn)率為0.524?g/g，高達(dá)理論值的86%，符合預(yù)期目的。以大腸桿菌ptsG基因缺陷菌株JH-B3為出發(fā)菌株，通過敲除編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mglB基因后，成功構(gòu)建了ptsG/mglB基因雙缺陷菌株JH-B6。JH-B3和JH-B6分別以葡萄糖和水稻秸稈水解液發(fā)酵L-丙氨酸時，JH-B6葡萄糖的利用速率較JH-B3分別下降了19.9%和23.0%，與預(yù)期結(jié)果相符;在水稻秸稈水解液發(fā)酵中，JH-B6利用還原糖和木糖的速率較JH-B3分別提高了45.1%和48.0%，也與預(yù)期結(jié)果相符;但以木糖發(fā)酵時，JH-B6利用木糖的速率較JH-B3提高了23.5%，這與預(yù)期結(jié)果不同，在敲除ptsG的基礎(chǔ)上再敲除mglB會直接影響大腸桿菌利用木糖的速率，其原因有待于進(jìn)一步研究。該研究在ptsG基因缺陷菌株JH-B3基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建了ptsG/mglB雙缺陷菌株JH-B6，在以水稻秸稈水解液發(fā)酵時，又進(jìn)一步使發(fā)酵周期縮短了31.3%，并且使L-丙氨酸轉(zhuǎn)率也提高4.9%，最終使菌株以水稻秸稈水解液發(fā)酵L-丙氨酸的效率得到了大幅度提升。

綜上所述，ptsG/mglB基因雙缺陷菌株JH-B6以水稻秸稈水解液發(fā)酵時，具有五碳糖利用效率高，L-丙氨酸轉(zhuǎn)化率高和發(fā)酵周期短的特點，不僅大幅降低葡萄糖效應(yīng)，而且還為利用農(nóng)作物秸稈等木質(zhì)纖維素工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸提供了理論基礎(chǔ)。

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