閔鈺,魏雪團

(華中農業(yè)大學 食品科學技術學院，湖北 武漢，430070)

亞精胺(spermidine)是一種具有強烈生物活性的低分子脂肪族含氮堿[1],作為多胺的一種，廣泛分布于生物體內，參與細胞的增殖、生長、組織再生、DNA和RNA的穩(wěn)定等過程，在細胞代謝中起重要作用[2-5]。隨著人們對亞精胺的逐步研究，發(fā)現亞精胺在機體健康和疾病方面具有重要功能，具有誘導細胞自噬、延緩衰老、提高記憶力、保護心血管、預防癌癥等多種生物活性[6-9]。有研究表明，隨著年齡的增長，人體內亞精胺濃度逐漸降低，這可能會影響人體的健康與壽命[10-13]。而通過外源攝入適量亞精胺來實現人體內亞精胺濃度的平衡，可能是促進健康、延緩衰老的有效策略[14-15]。

目前已報道多種微生物具有合成亞精胺的能力[16-19]。在微生物體內亞精胺可由腐胺(putrescine)和S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)合成，腐胺在亞精胺合成酶(spermidine synthase)作用下接受S-腺苷甲硫氨酸脫羧提供的氨丙基生成亞精胺[20-22]。KIM等[23]通過在釀酒酵母中強化表達鳥氨酸脫羧酶SPE1，S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶SPE2和亞精胺合成酶SPE3，同時敲除了鳥氨酸脫羧酶的抑制基因OAZ1，亞精胺的產量達到了63.6 mg/L。隨后研究發(fā)現,進一步敲除多胺轉運蛋白TPO1，亞精胺的產量進一步提升，最終通過發(fā)酵放大產量達到了224 mg/L[24]。也有研究者通過在集胞藻中強化表達精氨酸脫羧酶Adc1和Adc2基因，提高了細胞內亞精胺產量[25]。然而，目前的亞精胺產量普遍偏低，亞精胺合成機制和代謝工程育種還有待進一步發(fā)展。

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)具有安全性良好、生長快、易于培養(yǎng)等特點，廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品和農業(yè)領域[26-27]。隨著芽胞桿菌遺傳背景和分子操作工具的不斷完善和發(fā)展，芽胞桿菌已發(fā)展成為新的代謝工程底盤微生物，目前已逐漸被用來生產各種營養(yǎng)強化劑和食品添加劑[28-29]，但目前尚未有通過解淀粉芽胞桿菌合成亞精胺的相關報道。KEGG數據庫已預測解淀粉芽胞桿菌含有亞精胺合成途徑相關基因：speE基因編碼亞精胺合成酶，腐胺和S-腺苷甲硫氨酸在亞精胺合成酶催化下生成亞精胺。speE基因處于至關重要的位置，是合成亞精胺的關鍵，然而其功能尚未通過實驗驗證。本研究通過基因缺失和回補表達技術，從體內水平探究speE基因對亞精胺合成的影響，首次證實了speE基因在解淀粉芽胞桿菌亞精胺合成中的功能，為后續(xù)構建亞精胺高產工程菌株提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒

本研究所用到的菌株和質粒如表1和2所示。其中大腸桿菌DH5α用于構建載體，HSPM1為本實驗室保存的1株高產SAM的工程菌株。

表1 實驗用菌株

表2 實驗用質粒

注：Tetr：四環(huán)素抗性；Kanr：卡那霉素抗性；orits：溫敏型復制子

1.1.2 PCR引物

本研究所用的主要引物見表3。

1.1.3 主要試劑

TransStartRFastPfu DNA聚合酶和 TransStartReasyTaqDNA聚合酶,北京全式金公司；dNTPS、DNA限制性內切酶、T4DNA連接酶、DL5000 Marker,TaKaRa公司；DNA抽提試劑盒,武漢楚誠正茂科技工程有限公司；DNA回收試劑盒和質粒抽提試劑盒,美國OmegaBio-Tek公司；基因引物合成、測序,武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司；乙腈為色譜級，其他主要生化試劑均為國產分析級純。

表3 本研究所使用的PCR引物

注：粗體為限制性內切酶酶切位點，下劃線為重疊延伸拼接SOE-PCR的重疊區(qū)域

1.1.4 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸出粉5.0，NaCl 10.0，固體培養(yǎng)基加15～20 g/L的瓊脂粉?？股嘏囵B(yǎng)基添加相應抗生素終質量濃度為20 μg/L。亞精胺發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：木糖20.0，(NH4)2SO46.3，蛋白胨10.0，玉米漿20，NaCl 2.5，KH2PO43.0，MgSO4·7H2O 4.2，尿素2.0，天冬氨酸3.0，pH 6.5。

1.1.5 儀器與設備

Thermal Cycler(My Cycler)PCR儀，美國 Bio-Rad 公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器廠；HQL300B恒溫大幅振蕩搖床，武漢中科科儀技術發(fā)展有限責任公司；CR21G高速冷凍離心機，日本Hitachi公司；Legend Micro17R高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher Scientific 公司；SKP-02.420電熱恒溫培養(yǎng)箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；Agilent Technologies1260高效液相色譜，美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 敲除載體的構建

2014年3 月—2017年1月間，采用回顧性、抽樣調查方法，選擇118例在重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院診治的老年膝關節(jié)周圍骨腫瘤患者，納入標準：就診的初發(fā)未治膝關節(jié)周圍骨腫瘤患者；年齡≥60歲；膝關節(jié)周圍骨腫瘤診斷依據WHO標準；既往未曾治療；具有手術指征與化療指征；本研究得到了本院倫理委員會的批準。排除標準：精神疾病患者；合并嚴重心肝腎異?；颊?；妊娠與哺乳期婦女。根據治療方法不同將其分為各59例患者的觀察組與對照組，統(tǒng)計學對比基礎資料，兩組患者間無差異。見表1。

以B.amyloliquefaciensHZ-12的基因組DNA作為模板，利用上游同源臂引物(ΔspeE-AF,ΔspeE-AR)和下游同源臂引物(ΔspeE-BF，ΔspeE-BR)分別擴增出同源臂序列A和B，產物純化回收后通過SOE-PCR用引物ΔspeE-AF，ΔspeE-BR將A和B連接起來，并與T2(2)-ori載體同時用限制性內切酶BamH I和XbaI進行雙酶切，回收后用T4DNA連接酶連接，采用CaCl2轉化法轉化到E.coliDH5α感受態(tài)細胞。鈣轉化成功后提取質粒進行雙酶切驗證并送往測序公司測序，構建成功的敲除質粒命名為T2(2)-oriΔspeE。

1.2.2 基因敲除菌株的構建

將構建成功的質粒電轉化入HSPM1感受態(tài)細胞中，涂布至含Kan的抗性平板，37 ℃靜置培養(yǎng)16～18 h。挑選轉化子單菌落于Kan平板上劃線，培養(yǎng)8～12 h后用進行PCR菌落驗證(引物T2-F,T2-R)。將電轉正確的菌株45 ℃下進行單交換，ΔspeE-YF引物和T2引物驗證；獲得的單交換菌株在37 ℃下雙交換，挑選在LB板上長而在Kan抗性板上不長的單菌落，用ΔspeE-YF和ΔspeE-YF驗證，篩選到敲除菌株，命名為HSPM1ΔspeE。

1.2.3 游離表達載體的構建

以分別以B.subtillis168基因組、B.amyloliquefaciensHZ-12基因組和B.licheniformisWX-02基因組，根據表3相對應的引物，擴增出P43啟動子、speE基因、終止子TamyL。純化回收PCR產物，以P43-F、TamyL-R為引物通過SOE-PCR連接起來，與pHY300PLK質粒分別用BamH I和XbaI進行雙酶切，用T4連接酶連接PCR產物和質粒，并轉化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞。用pHY300-F和pHY300-R對單菌落進行PCR驗證，初步確定為陽性轉化子后，抽取質粒進行雙酶切和DNA測序驗證，構建成功的游離表達載體命名為pHYspeE。

1.2.4 基因回補菌株的構建

將抽提的pHYspeE和空載體pHY300PLK電轉化至HSPM1ΔspeE感受態(tài)中，涂布于Tet抗性平板，37 ℃靜置培養(yǎng)。挑選轉化子單菌落于Tet平板上劃線，用pHY300-F、pHY300-R進行PCR菌落驗證。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)條件

1.2.6 亞精胺液相檢測

取0.5 mL發(fā)酵液與1.5 mL 0.4 mol/L的高氯酸，混合酸提1 h，(12 000 r/min下離心5 min。吸取250 μL上清液，并依次加入100 μL(1 mg/mL)1, 7-二氨基庚烷，75 μL飽和NaHCO3溶液，50 μL 2 mol/L NaOH溶液以及500 μL(5 mg/mL丙酮)丹磺酰氯衍生劑，上下顛倒混勻。50 ℃水浴，避光反應45 min。再加入25 μL體積分數25% NH3·H2O并上下顛倒混勻，繼續(xù)放于50 ℃水浴中，避光靜置15 min。最后加入30 μL 6 mol/L HCl和575 μL乙腈，10 000 r/min離心5 min，取800 μL上清液0.22 μm有機膜過膜進行測定。

液相檢測使用ZORBAX Eclipse XDB-C18 色譜柱，流動相采用超純水和乙腈進行梯度洗脫，流速1 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

1.2.7 數據統(tǒng)計分析

每組實驗設計3個平行，采用SPSS 20.0進行數據統(tǒng)計分析，Origin 8.5進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 speE基因缺失菌的構建及其對亞精胺合成的影響

2.1.1speE基因缺失菌的構建

根據表3中引物獲得T2(2)-oriΔspeE敲除質粒的上下游同源臂，分別為546、520 bp，其中speE基因和其啟動子一同設計為被敲掉部分，SOE-PCR產物大小為1 066 bp。SOE-PCR融合產物與T2(2)-ori載體分別用BamHⅠ和XbaⅠ進行酶切、酶連后鈣轉化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞。PCR驗證顯示條帶正確的單菌落，抽提質粒測序并用BamHⅠ和XbaⅠ酶切質粒，電泳檢測結果如圖1-a所示，質粒雙酶切的跑膠條帶大小與預期相符合，測序結果顯示正確，表明敲除質粒T2(2)-oriΔspeE構建成功。

將敲除質粒T2(2)-oriΔspeE電轉化至HSPM1感受態(tài)細胞中，經過單雙交換篩選敲除菌株。抽提正確敲除菌株和未敲除菌株DNA，以speE-YF/speE-YR為引物，擴增的片段分別是1 291和2 232 bp，電泳檢測結果如圖1-b。將PCR擴增產物送往測序公司測序，比對結果正確，表明HSPM1敲除speE基因菌株構建成功，命名為HSPM1ΔspeE。

a-重組質粒T2(2)-oriΔspeE的雙酶切驗證; b- HSPM1ΔspeE菌株的PCR驗證;泳道 1：speE基因上下同源臂SOE-PCR融合片段;泳道 2：BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切質粒T2(2)-ori;泳道 3：BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切質粒T2(2)-oriΔspeE;泳道 4:引物ΔspeE-YF和ΔspeE-YR驗證HSPM1(2 232 bp);泳道 5:引物ΔspeE-YF和ΔspeE-YR驗證HSPM1ΔspeE(1 291 bp)

2.1.2speE基因缺失對亞精胺合成的影響

speE基因編碼亞精胺合成酶，腐胺和S-腺苷甲硫氨酸在亞精胺合成酶催化下生成亞精胺。為了考察speE基因對亞精胺合成的影響，按照材料與方法中1.1.5和1.2.5的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對工程菌株HSPM1ΔspeE進行發(fā)酵驗證，發(fā)酵周期60 h。用分光光度計測生物量OD600，HPLC檢測亞精胺含量。結果如圖2所示。

圖2 speE基因缺失對亞精胺合成的影響

從發(fā)酵驗證圖上看出，HSPM1與HSPM1ΔspeE的生物量OD600無顯著差別。對照菌株HSPM1亞精胺產量為36.6 mg/L，而工程菌株HSPM1ΔspeE，未檢測到亞精胺。在細菌的生長未受太大影響的情況下，工程菌株HSPM1ΔspeE未檢測到亞精胺，說明敲除speE基因后阻斷了亞精胺的合成，亞精胺的缺失是由speE基因引起，而不是生物量的降低。為了進一步確認亞精胺的降低是由speE基因缺失引起，構建speE基因回補菌株。

2.2 speE基因回補菌株的構建及其功能驗證

2.2.1speE基因回補表達菌株的構建

由于敲除speE基因后，完全不產亞精胺，推測亞精胺合成能力的喪失是由speE基因引起，為了證實speE基因在解淀粉芽胞桿菌中的功能，在HSPM1 ΔspeE菌株的基礎上構建speE回補表達菌株，探究speE基因在解淀粉芽胞桿菌中對亞精胺合成的影響。

根據表3的引物擴增出P43啟動子、speE基因、TamyL終止子大小與理論值大小一致(分別是305、831和501 bp)。SOE-PCR產物大小為1 637 bp，純化后與pHY300PLK載體分別用BamH I和XbaI進行酶切，用T4連接酶酶連后鈣轉化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞。選取驗證正確的陽性轉化子，抽提質粒并用BamH I和XbaI酶切質粒，電泳檢測結果如圖3-a，條帶大小與預期符合一致，測序結果顯示正確，表明pHY-speE質粒構建成功。

游離表達質粒pHY-speE電轉化至HSPM1ΔspeE中，挑選陽性轉化子用pHY300-F、pHY300-R進行PCR驗證，驗證結果如圖3-b。并送往測序公司進一步驗證堿基序列，比對結果無誤后表明HSPM1ΔspeE/pHYspeE工程菌株構建成功。

a-重組質粒pHY-speE的雙酶切驗證；b-菌株HSPM1ΔspeE/pHYspeE的PCR驗證;泳道1：speE基因、P43啟動子、TamyL終止子SOE-PCR融合片段;泳道2：BamH I和Xba I雙酶切質粒pHY300PLK;泳道3：BamH I和Xba I雙酶切質粒pHY-speE;泳道4～5:引物pHY300F和pHY300R驗證HSPM1ΔspeE/pHYspeE電泳圖

2.2.2speE基因回補對亞精胺合成的影響

按照材料與方法中1.1.5和1.2.5的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對工程菌株HSPM1、HSPM1ΔspeE、HSPM1ΔspeE/pHY300、HSPM1ΔspeE/pHYspeE進行發(fā)酵驗證，發(fā)酵周期60 h。發(fā)酵終點檢測生物量OD600和亞精胺產量。結果如圖4所示。

圖4 speE基因回補對亞精胺合成的影響

從圖4看，4株工程菌的生物量OD600值無明顯差別。工程菌株HSPM1ΔspeE/pHYspeE的發(fā)酵產量是62.32 mg/L，與對照菌HSPM1ΔspeE相比，回補speE基因后，亞精胺合成得到恢復，甚至高于未敲除speE基因的初始菌株HSPM1(33.34 mg/L)，這可能是由于游離表達質粒的拷貝數高所引起的。上述結果表明基因互補后，被阻斷的亞精胺合成途徑被修復，亞精胺的合成能力也得到恢復，進一步證實了speE基因是亞精胺合成途徑上的關鍵基因，證實了speE基因在亞精胺合成中的必要性，鑒定了speE基因在解淀粉芽胞桿菌中的功能。

3 結論

亞精胺是一種具有廣泛生物活性的生物胺，參與人體各類代謝反應。但是其高效生物合成卻一直是廣大科研工作者難以攻破的難題。本研究首次探究了解淀粉芽胞桿菌所預測的speE基因在亞精胺合成中的功能，成功構建了speE基因的缺失菌株HSPM1ΔspeE、回補菌株HSPM1ΔspeE/pHYspeE。通過發(fā)酵實驗，發(fā)現缺失speE并不會影響菌株的生物量，但卻顯著影響亞精胺的產量，直接導致菌株不產亞精胺；回補speE基因后菌株恢復亞精胺合成能力，從體內水平證實了speE基因在亞精胺合成中的功能。本研究首次證實了speE基因在解淀粉芽胞桿菌合成亞精胺中的功能，為亞精胺高產菌株的代謝工程育種提供了重要的基因資源。