楊歌 韓詩邈 趙麗萍 朱超 黃淵余 屈鋒

摘?要?基于毛細管電泳-指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)（CE-SELEX）建立了免疫球蛋白G（IgG）的Fc片段的核酸適配體篩選方法。通過毛細管區(qū)帶電泳方法分析IgG完整蛋白、Fc與Fab片段的樣品的純度、荷電性質(zhì)及是否吸附的特征，并比較三者與核酸庫的親和力。結(jié)果表明，IgG與核酸庫形成明顯的復合物，而Fc和Fab片段與核酸庫的親和力很弱。在篩選Fc片段的適配體時，選擇Fab片段作為反篩靶，對去除非特異性結(jié)合序列無顯著作用。設計了針對Fc片段的適配體篩選方案，在優(yōu)化的孵育條件（10 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4 （pH 7.17），0.05 mmol/L Mg2+，37℃孵育25 min）下，經(jīng)3輪篩選獲得Fc片段的核酸適配體Seq Fc1～3，KD值為0.071～0.321 μmol/L，經(jīng)膠體金比色分析方法驗證了其親和力與特異性。

關(guān)鍵詞?免疫球蛋白;免疫球蛋白G Fc片段;核酸適配體篩選;毛細管電泳;毛細管電泳-指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化

1?引 言

免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由效應B細胞分泌的可與相應抗原發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。免疫球蛋白由兩個不同的功能單元Fab和Fc片段組成。其中，F(xiàn)ab片段中包含了3個可變的互補決定區(qū)，用于結(jié)合特定的抗原表位;Fc片段能以多種方式參與免疫系統(tǒng)的調(diào)控[1]，可結(jié)合帶有Fc受體（FcγR）的免疫細胞，通過抗原呈遞細胞將抗原呈遞給自適應免疫系統(tǒng)的效應細胞，發(fā)揮清除作用[2，3]。另外，F(xiàn)c片段是許多蛋白質(zhì)的靶標，可作為銜接分子的配體發(fā)揮調(diào)控功能。Fc片段與相關(guān)效應分子的相互作用是免疫球蛋白功能實現(xiàn)的關(guān)鍵。

多種免疫球蛋白（IgA、IgD、IgE、IgG、IgM）均具有不同的生物分布與功能，在特定的觸發(fā)條件下發(fā)揮獨特的效應機制。IgG是最常用的免疫球蛋白，在大多數(shù)抗體反應中都涉及IgG介導的效應功能。IgG在基于抗體的療法中表現(xiàn)出良好的安全性，已成為治療傳染病的首選治療性抗體[3]。研究表明，可通過操縱IgG、Fc與Fc受體之間的相互作用改善IgG效應功能[4]，如誘變靶向IgG Fc核心或受體相互作用位點附近的氨基酸殘基以及Fc片段的糖基化等[5～7]。篩選Fc片段的特異性識別配體，可提供潛在的IgG Fc片段與其受體之間相互作用調(diào)節(jié)因子，進而控制IgG效應功能。

核酸適配體是通過體外篩選獲得的與目標分子有高親和力與特異性的寡核苷酸序列，可作為化學配體參與分子間相互作用調(diào)控，并可通過pH、光敏等方式形成可逆的調(diào)控開關(guān)[8，9]。目前，已有免疫球蛋白IgM、IgE與IgG的核酸適配體報道。Zumrut等[10]通過“配體引導選擇”方法（LIGS），經(jīng)13輪篩選獲得膜結(jié)合IgM（mIgM）的DNA適，可特異性結(jié)合B細胞淋巴瘤上的mIgM，用于癌癥相關(guān)的生物標志物檢測[11]。Bowser[12]通過毛細管電泳-指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)（CE-SELEX）方法經(jīng)4輪篩選獲得了人IgE的DNA適配體。Miyakawa等[13]通過Ni-NTA親和樹脂層析柱，經(jīng)10輪篩選獲得人IgG的RNA適配體，用于人IgG純化。上述適配體篩選均使用了抗體整體蛋白，由于Fc片段在免疫過程中也發(fā)揮特定的功能，因此，針對抗體的Fc片段篩選適配體也很有意義。本研究基于CE-SELEX建立了免疫球蛋白IgG的Fc片段的核酸適配體篩選方法。首先通過毛細管電泳方法評價IgG及其功能片段樣品的質(zhì)量以及其與核酸庫的親和力。在此基礎(chǔ)上，設計了Fc片段的篩選策略，優(yōu)化了篩選條件，并篩選獲得了Fc片段的核酸適配體，可能作為人IgG的潛在的效應功能調(diào)控因子。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀，配熒光檢測器（美國Beckman-coulter公司）;AUV220萬分之一電子天平（日本島津公司）;FE20實驗室pH計（瑞士梅特勒-托利多公司）;Fresco21低溫離心機、PICO21臺式高速離心機（美國賽默飛世爾科技有限公司）;S1000TM Thermal Cycler PCR儀、300V/400mA/75W Power凝膠電泳儀、水平電泳槽（美國BIO-RAD公司）;?KDM型控溫電熱套（山東鄄城華魯儀器公司）;熔融石英毛細管（i.d. 75 μm，邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司）。

H3BO3、Na2B4O7、NaOH、MgCl2、KCl（分析純，北京化工廠）;?NaH2PO4、KH2PO4（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。IgG（150 μg/mL，CUSABIO）;IgG的Fc片段（5 mg/mL，CUSABIO）;IgG 的 Fab片段（5 mg/mL，CUSABIO）。

55nt、70nt、80 nt FAM標記的ssDNA核酸庫： 5-FAM-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-N-CCT ATG CGT GCT ACC GTG AA-3（兩端為20 nt引物區(qū)固定序列，中間為N nt的隨機序列）。引物P1： 5-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3，標記熒光的引物5-FAM-P1： FAM-5-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3），引物P2： 5-TTC ACG GTA GCA CGC ATA GG-3（生工生物工程（上海）股份有限公司）。2×Taq Plus PCR Master Mix、 5 mL dd H2O、 500 μL Nuclelc Acid Dye Gene Green、1 mL 6×DNA Loading Buffer、 300 μL 50 bp DNA Ladder、 50 g瓊脂糖（天根生化科技有限公司）。

2.2?實驗方法

2.2.1?溶液配制?毛細管電泳分離緩沖溶液： 50 mmol/L硼酸硼砂溶液（pH 8.7）;蛋白與核酸孵育溶液： PBS緩沖液（pH 7.2）、5 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液（pH 7.17）;緩沖液均經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾后使用。蛋白質(zhì)溶液： 配制所需濃度的母液。再根據(jù)實驗需要，用孵育緩沖溶液稀釋。核酸溶液： 核酸固體粉末，使用前需按照說明用純水溶解，振蕩混勻，配制100 μmol/L母液，于94℃變性處理5 min，冷卻至室溫，備用。根據(jù)實驗需要，用孵育緩沖溶液稀釋。

2.2.2?毛細管電泳條件?75 μm內(nèi)徑的熔融石英毛細管，總長度 50.2 cm，有效長度 40 cm。UV檢測波長214 nm;LIF檢測激發(fā)和發(fā)射波長為488 nm和520 nm。電泳緩沖液： 50 mmol/L pH 8.7硼酸鹽緩沖液。進樣： 0.5 psi，5 s;分離電壓： 20 kV;分離溫度： 25℃。每個樣品進樣前依次使用0.1 mol/L NaOH、 H2O 和電泳緩沖液分別沖洗毛細管3 min。新毛細管使用前，依次用 1 mol/L NaOH、 0.1 mol/L NaOH 和蒸餾水沖洗30 min活化。實驗前，用0.1 mol/L NaOH，H2O和電泳緩沖液沖洗毛細管5 min。

2.2.3?PCR擴增條件及產(chǎn)物濃縮和純化?參考本課題組前期研究方法[14]。

2.2.4?序列分析與親和力表征?核酸序列高通量測序由生工生物公司完成，使用M-fold軟件分析序列二級結(jié)構(gòu)。平衡解離常數(shù)（Dissociation constant，KD）計算參考NECCEEM方法，計算公式如下[15，16]。

其中，[P]0為蛋白質(zhì)濃度;[DNA]0為適配體濃度;A1為游離適配體峰面積;A2為蛋白質(zhì)-配體復合物峰面積;A3為復合物解離區(qū)的峰面積。

2.2.5?膠體金比色分析

（1）AuNPs 制備?采用檸檬酸鹽還原法制備AuNPs，加熱 100 mL 1 mmol/L HAuCl4 溶液至沸騰;在同步攪拌下快速加入194 mmol/L 檸檬酸鈉溶液2 mL，沸騰15 min后取出反應燒瓶，并將反應溶液緩慢冷卻至室溫。（2）比色分析?在96孔板中，將25 μL膠體金溶液與等體積的5 μmol/L核酸序列孵育10 min，分別加入25 μL濃度梯度的靶蛋白，室溫孵育15 min，加入10 μL 900 mmol/L NaCl 溶液，觀察膠體金溶液顏色變化。

3?結(jié)果與討論

3.1?Fc片段的適配體篩選方案

IgG含有Fc片段和Fab片段。首先分別評估Fc片段和Fab片段與核酸庫的結(jié)合力。若Fc片段與核酸庫具有一定的親和力，二者可形成較穩(wěn)定的復合物，在CE電泳圖中顯示有復合物峰或解離區(qū)，則可直接以Fc片段作為靶標進行篩選;若Fc片段與核酸庫親和力極弱，則需以IgG為靶標進行篩選，獲得與完整IgG結(jié)合的核酸序列（其中包括結(jié)合Fc片段和Fab片段的所有序列），然后用Fab片段作為反篩靶，去除與Fab片段結(jié)合的序列，進而獲得可結(jié)合Fc片段的序列。前者直接進行正篩選，后者需要先篩選IgG的適配體，再進行反篩，間接獲得Fc片段的核酸適配體。

3.2?IgG、Fc和Fab的CZE分析

篩選前，分別對IgG、Fc片段、Fab片段進行毛細管區(qū)帶電泳（Capillary zone electrophoresis，CZE）分析，考察其純度、荷電性質(zhì)、在毛細管壁有無吸附等。圖1為3種組分的CZE分析圖。IgG在2.8 min出峰，峰形對稱，無明顯雜質(zhì)峰，說明IgG樣品純度較高。增加IgG濃度，其峰面積呈倍數(shù)增加，說明其在毛細管中無明顯吸附。Fc片段樣品在3.1 min有明顯的尖銳峰，濃度增加，峰面積也呈倍數(shù)增加，但該峰前出現(xiàn)彌散的非尖銳峰，并隨濃度增加增大，推斷是雜質(zhì)峰或Fc片段的其它形態(tài)。通過峰面積歸一化法，計算Fc片段純度為82.1%。若靶標中存在雜質(zhì)，可能會競爭結(jié)合核酸序列，也給復合物準確收集帶來困難。Fab片段在2.6 min出峰，濃度增加時，峰面積也增加。此峰略有拖尾，并有小的雜質(zhì)峰。采用歸一化法，計算Fab片段純度為96.2%。由圖1可見，3種組分的遷移時間在2.6～3.1 min之間，與核酸庫的遷移時間（6～7 min）有明顯差異，不會影響后續(xù)的復合物分離與收集。3種組分的峰面積與濃度呈正相關(guān)，說明它們在毛細管內(nèi)吸附很弱，故可用熔融石英毛細管直接進行適配體篩選。

3.3?IgG、Fc和 Fab與不同長度ssDNA庫的結(jié)合分析

因核酸庫的隨機序列長度對靶標的結(jié)合有明顯影響，故需要進行序列長度優(yōu)化。選擇3種隨機序列長度40、29和15 nt（ssDNAN40、ssDNAN29、ssDNAN15）的核酸庫，分別與3種靶標混合孵育。首先，在0.2 μmol/L ssDNAN40中加入不同濃度IgG（PBS緩沖液，pH 7.2，37℃孵育10 min），用CZE分析其混合物。在圖2A中，5.25 min為核酸庫峰，加入0.5 μmol/L IgG后，核酸庫峰降低，未見復合物峰與解離區(qū);當IgG為2 μmol/L時，核酸庫峰降低，并在其峰前出現(xiàn)復合物峰;IgG增加至10 μmol/L，核酸庫峰明顯降低，復合物峰面積繼續(xù)增大。在圖2B中，加入不同濃度的Fc（0.5～5 μmol/L）時，核酸庫峰面積沒有明顯降低。若Fc增加至10 μmol/L，核酸庫峰面積降低，但沒有明顯的復合物峰，而核酸庫峰前出現(xiàn)解離區(qū)。上述結(jié)果表明，F(xiàn)c與ssDNAN40的親和力小于IgG。在Fc與ssDNAN40濃度比高達50∶1時，仍無復合物峰出現(xiàn)，僅能觀察到復合物的解離區(qū)。在圖2C中，加入10～40 μmol/L Fab后，核酸庫峰面積沒有降低，也未見復合物峰和解離區(qū)，說明Fab片段與ssDNAN40作用極弱，在Fab與ssDNAN40濃度比高達200∶1時，也未見復合物峰和解離區(qū)。

由圖3A可見，在29 nt的核酸庫ssDNAN29中加入5 μmol/L IgG后，ssDNAN29峰的遷移時間從5.9 min明顯后移至6.2 min，在3.5 min（左上角放大圖）可見IgG與ssDNAN29的復合物彌散峰。加入Fc和Fab，ssDNAN29峰有所降低，但遷移時間沒有改變，且Fc和Fab與ssDNAN29未形成明顯的復合物峰。復合物峰面積IgG>Fab與Fc。由圖3B可見，在15 nt的核酸庫ssDNAN15中加入IgG、Fc和Fab，其結(jié)果與ssDNAN29非常相似。當靶標與核酸庫濃度比為25∶1時，兩種核酸庫與IgG、Fc、Fab的結(jié)合沒有明顯差異。IgG形成的復合物峰最大，親和力更強;Fc片段和Fab片段與核酸庫的作用較弱。完整IgG與核酸庫的親和力強于其功能片段Fc與Fab，說明核酸序列與IgG的結(jié)合并非完全發(fā)生在功能片段上，而也可能結(jié)合在蛋白的其它區(qū)域。如果使用完整蛋白作為靶標，篩選功能片段的適配體，則非特異性結(jié)合的干擾更大。在篩選Fc的適配體時，由于Fab與核酸庫的親和力極弱，且僅以Fab反篩也無法去除結(jié)合于IgG其它區(qū)域的核酸序列。因此，擬直接篩選Fc片段的核酸適配體。由于Fc與3種長度核酸庫的親和力都很弱，需進行相互作用條件的優(yōu)化，以促進復合物形成，提升親和力。

3.4?Fc片段的適配體篩選

3種長度的核酸庫與Fc片段結(jié)合力相當，而較長的核酸庫在次級庫及高通量測序建庫時，純化回收率較高，因此，選擇ssDNAN40用于Fc片段的適配體篩選。為提高ssDNAN40與Fc片段的親和力，優(yōu)化了二者的相互作用條件。孵育緩沖液為5 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4（pH 7.17），0.05 mmol/L Mg2+，F(xiàn)c與ssDNAN40核酸庫在37℃孵育25 min后，進行CZE分析。由圖4A可見，在優(yōu)化的孵育條件下，F(xiàn)c與ssDNAN40結(jié)合，可形成明顯的復合物Complex Fc。相同條件下，F(xiàn)ab與ssDNAN40沒有明顯結(jié)合。收集復合物（圖4B），經(jīng)不對稱PCR擴增和純化，得到第1輪的次級庫（Sub-library-2）用于第2輪篩選（圖4C），重復篩選步驟得到第2輪的次級庫（Sub-library-3）（圖4D）。經(jīng)4輪篩選后，KD從第1輪的（928.3±57.5） μmol/L降為第4輪的（51.76±15.9） μmol/L（圖4E），次級庫的親和力隨篩選輪次增加。第3輪和第4輪篩選的親和力相當，故從第3輪次級庫中選擇候選核酸序列。

將第3輪篩選的次級庫PCR擴增后送至生工生物科技有限公司進行高通量測序，從測序結(jié)果中選擇頻數(shù)最高的3條序列Seq Fc1～Seq Fc3（表1）。經(jīng)M-fold模擬序列二級結(jié)構(gòu)及預測熱力學參數(shù)，結(jié)果顯示，這些序列普遍形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖5）。Seq Fc1與Seq Fc2的ΔG低于Seq Fc3，說明二者較Seq Fc3更易折疊成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。Seq Fc1與Seq Fc2熔解溫度Tm均高于Seq Fc3，說明二者的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高于Seq Fc3。測定3條候選適配體序列的親和力，其KD值為0.071～0.321 μmol/L。

3.5?納米金比色法驗證適配體親和力與特異性

利用AuNPs比色法快速驗證3條候選序列對Fc結(jié)合的特異性。在25 μL AuNPs溶液中分別加入等體積的4 μmol/L Seq Fc1、2、3，室溫混合孵育15 min 后，加入 NaCl，溶液呈酒紅色。分別加入 0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5 μmol/L的Fc片段，溶液由酒紅色向藍色轉(zhuǎn)變 （圖6A）。加入0.2 μmol/L Fc片段，Seq Fc1 和Seq Fc2的溶液已呈現(xiàn)為紫色。而加入0.5 μmol/L Fc，Seq Fc3溶液才呈現(xiàn)紫色。3條序列的顏色轉(zhuǎn)變點處的Fc濃度不同，F(xiàn)c濃度越低，表明其親和作用更強，親和力表征結(jié)果與CE方法一致。3條適配體溶液中分別加入相同系列濃度的Fab，AuNPs溶液仍保持酒紅色（圖6B），說明3條序列均不能結(jié)合Fab，而與Fc片段能夠特異性結(jié)合。

4?結(jié) 論

基于CE-SELEX建立了免疫球蛋白IgG Fc片段的DNA適配體篩選方法，通過對IgG完整蛋白、Fab片段與Fc片段與核酸庫的親和力表征，設計針對Fc片段的適配體篩選策略。結(jié)果表明，IgG可與核酸庫形成明顯的復合物，而Fc片段和Fab片段與核酸庫的親和力很弱。在Fc片段適配體篩選過程中，選擇Fab片段作為反篩靶，對去除Fc片段的非特異性結(jié)合序列無顯著作用。在優(yōu)化條件下，經(jīng)3輪篩選直接獲得Fc片段的特異性核酸適配體。此適配體有望用于IgG的效應功能調(diào)控。

References

1?Chan K R，Ong E Z，Mok D Z，Ooi E E. Expert. Rev. Anti-Infect. Ther.，2015，13（11）： 1351-1360

2?Roopenian D C，Akilesh S. Nat. Rev. Immunol.，2007，7（9）： 715-725

3?Fonseca M H G，F(xiàn)urtado G P，Bezerra M R L，Pontes L Q，F(xiàn)ernandes C F C. Int. J. Biol. Macromol.，??2018，119： 306-311

4?Shen Y，Li H，Zhao L，Li G，Chen B，Guo Q，Gao B，Wu J，Yang T，Jin L，Su Y. PLoS One，??2017，12（8）： e0183326

5?Suzuki T，Ishii-Watabe A，Tada M，Kobayashi T，Kanayasu-Toyoda T，Kawanishi T，Yamaguchi T. J. Immunol.，2010，184（4）： 1968-1976