邢海洋, 張硯迪, 王可心, 闞 亮

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院, 1. 放療中心; 2. 老年病科, 遼寧 沈陽, 110022)

中華獼猴桃根屬于獼猴桃科植物，在中國的主要生長地包括杭州、溫州等城市的南部區(qū)域[1], 其在祛風(fēng)除濕、清熱解毒、活血消腫方面具有良好的效果。當(dāng)代藥理學(xué)研究[2]顯示，獼猴桃根對于消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤(如食管癌、胃癌、肺癌等)具有較好的治療作用，此外對乳腺癌也有較好的效果，擁有廣泛的抗癌細(xì)胞活性。隨著對獼猴桃根有效成分和藥理功效的研究[3-4]不斷深入，從中華獼猴桃根中提煉出生物堿類、黃酮類、三萜類、蒽醌類、苯丙素類等多種成分，這些化學(xué)活性成分可有效發(fā)揮抗癌作用[5-6]。2018年2月—2019年11月，作者觀察了中華獼猴桃根提取物對肝癌細(xì)胞Bel-7402的放療增敏作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 獼猴桃根的提取和分離

選用產(chǎn)自浙江省金華市的獼猴桃根，將500 g干燥產(chǎn)物粉粹后，進(jìn)一步采用2 L甲醇回流，共計回流3次; 過濾并真空干燥后，溶解于蒸餾水中。水相提取物分別應(yīng)用氯仿、正丁醇、乙酸乙酯提取3次，最終獲得氯仿組分、正丁醇組分和乙酸乙酯組分。氯仿組分進(jìn)一步利用H60硅膠柱層析(長25 cm, 內(nèi)直徑5 cm), 選取氯仿，甲醇梯度(50∶1, 20∶1, 10∶1, 5∶1, 2∶1, 1∶1, 200 mL/次)洗脫，烘干，并置于4 ℃冰箱備用。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

購買肝癌細(xì)胞Bel-7402株，將其傳代、培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，同時加入100 mg/L鏈霉素、1×105U/L青霉素，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取處于對數(shù)生長期的肝癌Bel-7402細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測Bel-7402細(xì)胞的凋亡

將對數(shù)生長期的肝癌Bel-7402細(xì)胞接種于含有8×104個/孔的含有完全培養(yǎng)基2 mL的6孔板中，隨后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24 h, 直至細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基。采用6 MV X射線進(jìn)行Bel-7402細(xì)胞照射，射野范圍10 cm×10 cm, 皮距100 cm。設(shè)0、1、2、3、4、6 Gy共6個劑量點(diǎn)，依次分為單純放療組、單純藥物組和聯(lián)合放療組。聯(lián)合放療組在放療的同時加入2 mL終濃度為160 μg/mL的獼猴桃根提取物完全培養(yǎng)液，接種的細(xì)胞數(shù)與單純放療組相比適量提高，且與照射劑量呈正相關(guān)。將上述細(xì)胞放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h后收集貼壁細(xì)胞和上清液，并將其置于15 mL離心管中，采用PBS預(yù)冷洗滌2次, 1 000 轉(zhuǎn)/s離心5 min后，棄掉上清。每組接下來再分別加入100 μL buffer, 然后吹打均勻后各加入5 μL 碘化丙啶(PI)、5 μL AnnexinV, 常溫條件下進(jìn)行染色0.5 h, 注意避光。之后2組依次再次加入300 μL buffer, 應(yīng)用200目濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，并將其收集于2 mL圓底EP管中。每個樣品的1萬個細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀采集熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，采用525 nm作為檢驗(yàn)波長, 488 nm激光作為激發(fā)波長。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Hochest33258染色觀察野生獼猴桃根提取物對肝癌細(xì)胞Bel-7402形態(tài)的影響

采用70%乙醇浸泡蓋玻片過夜后，置于含8×104個/孔的6孔板中，每孔加2 mL完全培養(yǎng)基，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 等待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，用6 MV X射線進(jìn)行細(xì)胞照射，射野范圍10 cm×10 cm, 皮距100 cm。設(shè)0、1、2、3、4、6 Gy共6個劑量點(diǎn)，分為單純放療組、單純藥物組和聯(lián)合放療組。聯(lián)合放療組在放療的同時加入2 mL終濃度為160 μg/mL的獼猴桃根提取物完全培養(yǎng)液，接種細(xì)胞數(shù)較單純放療組適當(dāng)提高，且與照射劑量呈正相關(guān)。放置于培養(yǎng)箱中再次培養(yǎng)48 h后，按照染色試劑盒步驟進(jìn)行操作，在發(fā)射波長約460 nm、熒光激發(fā)波長約350 nm的熒光顯微鏡下觀察并比較細(xì)胞核形態(tài)。

1.5 存活分?jǐn)?shù)及細(xì)胞存活曲線

采用6 MV X射線行細(xì)胞照射，射野范圍10 cm×10 cm, 皮距100 cm。設(shè)0、1、2、3、4、6 Gy共6個劑量點(diǎn)，分為單純放療組和聯(lián)合放療組。聯(lián)合放療組在放療的同時加入2 mL終濃度為160 μg/mL的獼猴桃根提取物完全培養(yǎng)液，接種細(xì)胞數(shù)較單純放療組適當(dāng)提高，且與照射劑量成呈相關(guān)多。相互作用72 h后，用PBS洗滌以去掉獼猴桃根提取物完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d后染色，并進(jìn)一步計數(shù)克隆數(shù)。

存活分?jǐn)?shù)=某一劑量聯(lián)合放療組克隆形成率/單純放療組克隆形成率。將照射劑量作為橫坐標(biāo)(線性坐標(biāo))，存活分?jǐn)?shù)作為縱坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo))，得到設(shè)定下的細(xì)胞存活曲線。

2 結(jié) 果

2.1 不同加藥濃度對細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，與單純放療組、單純藥物組相比，聯(lián)合放療組Bel-7402凋亡細(xì)胞的比例顯著增多(Q4區(qū)細(xì)胞數(shù)明顯增加)。從凋亡細(xì)胞分布情況進(jìn)行分析，藥物主要引起中、晚期Bel-7402細(xì)胞凋亡和壞死，對早期細(xì)胞凋亡無明顯影響。見圖1。

A: 單純藥物組細(xì)胞凋亡情況; B: 單純放療組細(xì)胞凋亡情況; C: 聯(lián)合放療組細(xì)胞凋亡情況。

圖1 不同加藥濃度對細(xì)胞凋亡的影響

2.2 Hocheset33258染色下不同加藥濃度對細(xì)胞核形態(tài)的影響

通過Hocheset33258染色顯示出不同加藥濃度對細(xì)胞核形態(tài)變化的影響，單純藥物組細(xì)胞核表現(xiàn)為染色均勻，輪廓清晰完整，核膜光滑，同時可以觀察到分裂期細(xì)胞核的變化; 單純放療組細(xì)胞核中可見固縮的染色質(zhì)，并且呈現(xiàn)出濃染致密的藍(lán)色，同時可以觀察到細(xì)胞核的碎裂; 與單純放療組相比，聯(lián)合放療組正常細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，而凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，說明野生獼猴桃根提取物對肝癌細(xì)胞Bel-7402的放療具有增敏作用。見圖2。

A: 單純藥物組細(xì)胞形態(tài); B: 單純放療組細(xì)胞形態(tài); C: 聯(lián)合放療組細(xì)胞形態(tài)。

圖2 Hocheset33258染色下不同加藥濃度對細(xì)胞核形態(tài)變化的影響(放大倍數(shù)100倍)

2.3 單純放療組與聯(lián)合放療組細(xì)胞存活曲線

與單純放療組相比，聯(lián)合放療組細(xì)胞存活曲線顯示細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯降低，表明中華獼猴桃根提取物對肝癌細(xì)胞Bel-7402具有放療增敏作用。見圖3。

圖3 單純放療組與聯(lián)合放療組細(xì)胞存活曲線

3 討 論

放療是治療肝癌的常用方法，但其療效欠佳[7-8], 究其原因?yàn)榉暖煂φ８闻K組織的損害限制了放療劑量，患者的放療耐受性也較差。因此，增加放療過程中腫瘤細(xì)胞對射線的敏感性，同時減少放療對肝臟及其臨近器官的損害，是提高放療療效的關(guān)鍵[9-10]。本研究以中華獼猴桃根提取物作為肝臟惡性腫瘤細(xì)胞Bel-7402的放療增敏劑，結(jié)果顯示中華獼猴桃根提取物對Bel-7402細(xì)胞有放療增敏功效，其機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

選用160 μg/mL作為獼猴桃根提取物完全培養(yǎng)液的放療增敏濃度，是因?yàn)樵撡|(zhì)量濃度表現(xiàn)

出較高的細(xì)胞凋亡率。通過細(xì)胞存活曲線可以看出，放療增敏作用在160 μg/mL質(zhì)量濃度時有較好的體現(xiàn)。放療和160 μg/mL獼猴桃根提取物完全培養(yǎng)液聯(lián)合應(yīng)用，一方面可以使細(xì)胞存活曲線的平均致死劑量變小; 另一方面表現(xiàn)為細(xì)胞存活曲線肩區(qū)明顯狹窄。上述結(jié)果表明，中華獼猴桃根提取物對肝臟惡性腫瘤細(xì)胞Bel-7402有放療增敏功效，考慮原因可能為中華獼猴桃根提煉物具有直接抗癌功效，與放療聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，而中華獼猴桃根提煉物還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。