豬腰豆質量控制研究

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【摘 要】目的：建立豬腰豆藥材質量控制的方法。方法：采用TLC法進行定性鑒別，采用HPLC法進行定量分析，色譜柱為COSMOSIL5C18-PAQ，以甲醇-0.2%磷酸為流動相梯度洗脫，柱溫為35 ℃，流速為0.8 mL/min。結果：薄層色譜特征斑點清晰，專屬性強。刺芒柄花苷濃度范圍在0.001 8～0.014 1 mg·mL-1內呈良好的線性關系;線性回歸方程為Y=6.193×104X-0.65（r=0.999 9）;刺芒柄花素濃度范圍在0.001 3～0.010 0 mg·mL-1內呈良好的線性關系;回歸方程為Y=1.873×104X-0.521（r=0.999 8）;精密度、重復性、穩(wěn)定性及加樣回收試驗結果均符合質量標準研究的要求。結論：TLC法專屬性強、重復性好，HPLC法靈敏度高、操作方法簡單，本研究可為豬腰豆藥材的進一步開發(fā)研究及建立質量標準提供實驗參考。

【關鍵詞】豬腰豆;薄層色譜法;高效液相色譜法;含量測定

【中圖分類號】R284 【文獻標識碼】A 【文章編號】1674-0688（2020）03-0086-04

豬腰豆[Whitfordiodendron filipes（Dunn）Dunn]又名大莢藤、細梗惠特木、白藤花、豬腰子。豬腰豆是豆科（Leguminosae）豬腰豆屬（Whitfordiodendron Elmer）植物[1-3]的藥用部位，主要分布于云南、廣西等地。豬腰豆可藥用、食用。在民間，豬腰豆一般被當做補腎助陽、清熱解毒的藥物，且其藤莖還被用來治療跌打損傷、祛風補血、調理月經，其花可食用[4]。劉玉嬌[5]對豬腰豆的有效成分及藥理作用進行了研究，結果表明黃酮類化合物是豬腰豆藥材的主要有效成分之一，具有抗心血管疾病等多種活性[6]。

芒柄花黃素（Formononetin，F(xiàn)orm）又名刺芒柄花素，為黃酮類化合物，是一種富含黃芪側根的異黃酮類植物雌激素[7]。通過查閱文獻，眾多學者對刺芒柄花素的成分含量、藥理作用及對癌細胞進行了研究。韋建華等人[8-9]從壯藥兩粵黃檀中提取分離得到芒炳花黃素。張華[10]采用了高效液相色譜（HPLC）法測定芒炳花素的含量。韓明陽等人[11]采用高效液相色譜波長切同時測定康復春口服液中黃芪指標性刺芒柄花素的成分。黃保勝等人[12]通過SphK1-SIP信號通路抑制大鼠局灶性腦缺血再灌注的影響，具有改善腦缺血，降低腦含水量，具有保護作用[13]。費洪新等人[14]研究芒柄花黃素對阿爾茨海默病小鼠結構的影響。董陳誠等人[15]研究發(fā)現(xiàn)，芒柄花黃素能抑制人胃癌細胞系MKN-45的增殖，促進細胞凋亡。已有研究表明芒柄花黃素能抑制膀胱癌T24細胞和EJ細胞增殖、對膀胱癌T24細胞的增殖起顯著抑制作用[16]。王茹月等人[17]提出芒柄花黃素對乳腺、前列腺、膀胱、肺、子宮內膜、卵巢對多種惡性腫瘤顯示出良好的抑制作用。在一定濃度范圍內，芒柄花黃素對惡性腫瘤的抑制作用呈劑量-時間依賴性。但在某些實驗中較低濃度芒柄花黃素對癌細胞抑制作用不明顯，甚至促進癌細胞增殖[18-19]。芒柄花黃素具有對機體損傷的保護作用、降低血清LDL膽固醇、改善骨密度、調節(jié)激素分泌等預防保健功效，對人體內環(huán)境和穩(wěn)態(tài)起到良性調節(jié)，這可能是它發(fā)揮抗癌作用的重要機制之一。例如，芒柄花黃素能有效抑制雌激素依賴性子宮內膜癌細胞中FOXA1和GATA-3蛋白的表達而使雌激素受體水平下降，改善體內的內分泌微環(huán)境，從而改善患者預后[20]。此外，芒柄花黃素的抗炎作用可以幫助機體清除代謝廢物，使機體處于良好的適于正常細胞代謝的環(huán)境，增強機體對癌細胞的免疫力。

豬腰豆中所含的有效成分雖被報道有多種治療作用，但目前對其質量控制還未形成系統(tǒng)性的標準，國內外對豬腰豆的質量標準研究幾乎空白。本實驗對豬腰豆采用薄層色譜法進行定性分析并采用高效液相色譜法進行含量測定，為更深入地對豬腰豆的品質評價標準進行探討，并期望在開發(fā)豬腰豆抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抑細菌、抗衰老等藥物中提供實驗基礎，為豬腰豆的質量控制提供科學依據。

1 實驗藥材、試劑與儀器

（1）實驗藥材。豬腰豆采集于廣西南寧，由廣西中醫(yī)藥大學韋松基教授鑒定為豬腰豆（Whitfordiodendron filipes（Dunn）Dunn）的地上部分。

（2）實驗試劑見表1。

（3）儀器設備見表2。

2 實驗方法與結果

（1）薄層鑒別。

（2）豬腰豆供試品溶液的制備。稱取藥材粗粉適量，過三號篩，取藥材粉末約6 g，置于具塞錐形瓶中，加入MeOH溶劑30 mL，超聲波提取30 min，濾過，濾液濃縮至1 mL即得。

（3）刺芒柄花素對照品溶液的制備。取刺芒柄花素對照品約1 mg，加入甲醇進行溶解，即得對照品溶液。

（4）刺芒柄花苷對照品溶液的制備。取刺芒柄花苷對照品約1 mg，加入甲醇進行溶解，即得對照品溶液。

（5）薄層色譜試驗及結果。根據2015版《中國藥典》四部通則0502試驗，取硅膠G薄層板，105 ℃活化30 min后，吸取供試品溶液、刺芒柄花素對照品溶液、陰性對照品溶液2～5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸（20∶1∶4 d）為展開劑展開，展距為7 cm，取出，晾干。在紫外光燈（365 nm）下檢測。結果顯示刺芒柄花素對照品和豬腰豆供試品在相同的Rf值位置上顯相同顏色斑點，分離度好、斑點清晰（如圖1所示）。

根據2015版《中國藥典》四部通則0502試驗，分別吸取供試品溶液、刺芒柄花苷對照品溶液、陰性對照品溶液2～5 μL，分別點于同一聚酰胺薄層板上，以甲醇∶水∶冰醋酸（7∶1∶4 d）為展開劑展開，展距為7 cm，取出，晾干。在紫外光燈（365 nm）下檢測，結果顯示刺芒柄花苷對照品和豬腰豆供試品在相同的Rf值位置上顯示相同顏色斑點，分離度好、斑點清晰（如圖2所示）。

3 含量測定方法與結果

3.1 色譜條件

色譜柱：COSMOSIL5C18-PAQ色譜柱（250 mm×4.6 mm;5 μm）;流動相：甲醇（C）～0.2% 磷酸水溶液（D）;梯度洗脫。流速：0.8 mL/min;檢測波長：雙波長切換檢測（見表3）;柱溫為35 ℃;進樣量為10 μL。

3.2 對照品溶液的制備

精密稱取刺芒柄花苷對照品3.060 0 g，加甲醇定容至10 mL，得到刺芒柄花苷對照品濃度為0.306 0 mg/mL，精密稱取刺芒柄花素對照品1.150 0 g，加甲醇定容至5 mL，得到刺芒柄花素對照品濃度為0.230 0 mg/mL。精密取上述刺芒柄花苷對照品溶液20 μL定容到1.5 mL量瓶中，即得刺芒柄花苷濃度為0.004 mg/mL，精密取刺芒柄花素對照品溶液46 μL定容到1.5 mL量瓶中，即得刺芒柄花素濃度為0.007 mg/mL。取上述刺芒柄花苷、刺芒柄花素各1 mL等量混合，得混合對照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備

取藥材粗粉適量，三號篩過濾，取藥材粉末約6 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入60%甲醇30 mL，稱重，加熱回流提取2 h，濾過，冷卻后稱定重量，用60%甲醇補足減失的重量，搖勻并濾過。所得濾液經0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。

4 方法學考察

（1）系統(tǒng)適用性試驗。分別精密吸取“3.2”項下混合對照品和“3.3”項下供試品各10 μL，按“3.1”項色譜條件下進樣，結果供試品溶液中待測成分色譜峰與對照品溶液色譜峰保留時間一致，并且可達到有效的分離，分離度均大于1.5，表明本方法專屬性良好。高效液相色譜圖如圖3所示。

（2）線性關系考察。分別精密吸取“3.2”項下對照品刺芒柄花素的質量濃度依次為0.001 2 mg/mL、0.003 7 mg/mL、0.006 3 mg/mL、0.007 5 mg/mL、0.010 1 mg/mL，質量濃度依次為0.001 8 mg/mL、0.005 3 mg/mL、0.008 8 mg/mL、0.106 0 mg/mL、0.101 4 mg/mL的刺芒柄花苷各10 μL按“3.1”項下色譜條件進樣測定，進樣濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，得到刺芒柄花素和刺芒柄花苷的線性范圍及標準曲線（如圖4所示），結果見表4。

（3）精密度試驗。取“3.2”項下混合對照品溶液，分別進樣10 μL在“3.1”色譜條件下連續(xù)進樣6次，計算峰面積結果見表5、表6。

（4）重復性試驗。按“3.3”項下方法制備得到6份供試品溶液，分別進樣10 μL，按“3.1”色譜條件下檢測，計算峰面積結果見表7、表8。

（5）穩(wěn)定性試驗。按“3.3”項下方法制備得到供試品溶液，在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h分別進樣10 μL，按“3.1”色譜條件下檢測，記錄峰面積，計算刺芒柄花素、刺芒柄花苷結果見表9、表10，刺芒柄花素、刺芒柄花苷峰面積值RSD均小于3%，表明供試品在24 h內穩(wěn)定性良好。

（6）加樣回收試驗。取供試品6份，精密稱定，分別精密加入一定量的對照品，按“3.1”色譜條件下測定并記錄峰面積，計算各成分加樣回收率。結果見表11。

（7）樣品含量的測定。取供試品3份，按“3.3”項下制備得到供試品溶液，按“3.1”色譜條件下測定，計算樣品中刺芒柄花素、刺芒柄花苷的含量。結果見表12。

5 結論

本次課題對于豬腰豆的TLC鑒別方法專屬性強，可用于樣品的定性分析。HPLC含量測定方法學結果顯示，可用于樣品的定量分析。該方法測定結果有較高的準確度，表明所建立的定性、定量分析方法可行，對豬腰豆的鑒定及質量控制具有一定的指導意義和參考價值。

6 討論

（1）刺芒柄花素展開劑考察。分別考察了石油醚-乙酸乙酯等多種展開體系。通過以上摸索，結果發(fā)現(xiàn)，展開劑選用的體積比為二氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸（20∶1∶4 d）時，斑點清晰、分離度好，Rf值為0.57。

（2）硅膠板的考察。分別考察了自鋪板和市售板，在相同的樣品、對照品及展開條件下，結果顯示，自鋪板斑點分離差，對照品Rf值為0.50，樣品Rf值為0.53;而市售板斑點分離較好，對照品及樣品Rf值為0.70，經過對比，市售板點出的斑點較自鋪板好。

（3）顯色劑考察。黃酮類化合物顯色劑采用紫外線氨熏、1%三氯化鋁乙醇溶液，結果顯示紫外線氨熏顯示的斑點更清晰，分離度較好，無拖尾現(xiàn)象;而1%三氯化鋁乙醇液結果顯示斑點顏色不清晰，有拖尾現(xiàn)象，故選用紫外線氨熏做顯色劑。

（4）刺芒柄花苷展開劑考察。因刺芒柄花苷極性較大，分別考察了二氯甲烷-甲醇-冰醋酸等多種展開劑體系。結果發(fā)現(xiàn)，展開劑選用甲醇∶水∶冰醋酸（7∶1∶4 d）時，斑點清晰，分離度較好。

（5）流動相考察。考察甲醇-0.1%磷酸等流動相，結果表明，以甲醇-0.2%磷酸作流動相，基線平穩(wěn)，故確定流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液。本實驗考察60%、70%、80%不同濃度甲醇，加熱回流和超聲不同提取方式，結果顯示，60%濃度回流提取方法更理想，具有良好的分離度、基線較平穩(wěn)。

（6）柱溫考察。分別考察25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的柱溫，結果顯示，在35 ℃時，基線較平穩(wěn)，分離度較好。

（7）波長考察。本次實驗對兩種成分進行了紫外-分光光度計全波長掃描發(fā)現(xiàn)，刺芒柄花苷在230～258 nm處有最大吸收波長。刺芒柄花素在236～248 nm處有最大吸收波長。

參 考 文 獻

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