碳酸鈣對凝結芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢形成的影響

田晶晶，吳 影,2，李長福，周艷林，周子呂，古紹彬,2,3,*

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.河南省食品微生物工程技術研究中心，河南 洛陽 471023；3.食品加工與安全國家級實驗教學示范中心，河南 洛陽 471023）

近年來，凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）由于具有增加腸道原有益生菌數(shù)量[1]、治療腹瀉增強免疫[2-3]、改善腸易激綜合征[4]、降低膽固醇[5]、抑制致病菌的生長[6]等益生特性，被廣泛應用于食品、藥品、保健、畜牧水產(chǎn)等[7]。該菌作為最具潛力的益生菌之一，受到國內(nèi)外學者廣泛關注[8]。目前，凝結芽孢桿菌已先后被美國食品與藥品監(jiān)督管理局、歐洲食品與飼料菌種協(xié)會和國際乳品聯(lián)合會認定為一般認為安全的（generally recognized as safe，GRAS）菌種，并被列入美國農(nóng)業(yè)部和美國飼料控制委員會名單。我國于2004年批準在飼料中添加，于2005年批準其作為人用整腸藥物；并于2016被國家衛(wèi)生健康委員會（原國家衛(wèi)計委）列入《可用于食品的菌種名單》。作為新型益生菌，凝結芽孢桿菌常以芽孢形式添加。芽孢桿菌的芽孢是營養(yǎng)細胞的休眠體，在胃酸環(huán)境中被激活萌發(fā)后具有和營養(yǎng)細胞一樣的益生特性，且芽孢更具有耐酸、耐膽鹽、耐高溫等極強的耐受特點，因此工業(yè)生產(chǎn)過程中芽孢比營養(yǎng)細胞具有更好的工業(yè)性能[9]。有研究指出，凝結芽孢桿菌芽孢在進入人體后4～6 h內(nèi)即可萌發(fā)形成營養(yǎng)細胞，并繁殖發(fā)揮益生作用，其中能夠順利通過消化系統(tǒng)的芽孢高達85%[10]。

目前，關于凝結芽孢桿菌的芽孢化途徑及調(diào)控機制鮮有報道，有關細菌芽孢形成機理的研究主要集中于枯草芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌[11]，且較明確的是芽孢桿菌芽孢化過程主要經(jīng)歷8 個階段，其中芽孢化啟動對芽孢形成至關重要，而芽孢化啟動調(diào)控因子Spo0A含量及磷酸化水平則是芽孢啟動與否的關鍵環(huán)節(jié)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)Spo0A的磷酸化是由KinA、KinB、KinC、KinD、KinE 5 種組氨酸激酶調(diào)控，組氨酸激酶種類越高，所能應答的環(huán)境刺激范圍就越廣[14]。磷酸化的Spo0A能夠直接調(diào)控與芽孢形成相關的一系列基因的表達，如參與調(diào)控母細胞中的sigma因子（σH，σF，σE，σK，σG）表達等[15-16]。

Moeller等[17]研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有芽孢桿菌的芽孢都具有同等穩(wěn)定性，刺激形成的因素不同，芽孢的抗逆性也會存在差異。Olivier等[18]發(fā)現(xiàn)，較高溫度下形成的芽孢具有更強的耐熱性能；培養(yǎng)基中礦物質離子（Ca2+、Mn2+、Mg2+）的添加也能增加形成芽孢的耐熱性能，但也降低了芽孢其他的抗逆性。芽孢桿菌在芽孢形成時，需攝入大量Ca2+，以確保生成足夠的吡啶二羧酸鈣，后者可使芽孢中的生命大分子物質形成穩(wěn)定凝膠，從而提高其耐熱性[19]。同時，Ca2+是芽孢形成過程中相關蛋白酶及蛋白水解酶重要的輔因子[20]，因此能夠顯著促進芽孢的形成。碳酸鈣還可穩(wěn)定發(fā)酵液pH值，防止過酸環(huán)境對芽孢形成的影響。關于碳酸鈣添加對芽孢形成及耐受性方面的研究卻鮮見相關報道，本實驗旨在研究凝結芽孢桿菌CGMCC 9951在碳酸鈣作用下的芽孢形成情況及抗逆性，探究碳酸鈣在凝結芽孢桿菌芽孢形成中的促進作用，以期為工業(yè)化生產(chǎn)凝結芽孢桿菌芽孢提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

凝結芽孢桿菌CGMCC 9951為河南科技大學食品與生物工程學院微生物育種與代謝調(diào)控研究室分離保藏。

種子及發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15 g，蛋白胨15 g，酵母粉10 g，硫酸鎂5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 8.0±0.05，115 ℃滅菌30 min；計數(shù)培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基添加2%的瓊脂，115 ℃滅菌30 min。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：稱取8.0 g氯化鈉、0.2 g氯化鉀、0.24 g磷酸二氫鉀、1.44 g磷酸氫二鈉，溶解于800 mL蒸餾水中，2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH 7.4，定容至1 000 mL混勻室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

Trizol提取試劑盒、4S Red Plus核酸染色劑（BBI A606695）、瓊脂糖、第一鏈cDNA合成試劑盒 （Thermo Scientific? EP0733）、SG Fast qPCR Master Mix（High Rox） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機 美國賽洛捷克有限公司；PH400型臺式pH計 安萊立思儀器科技公司；DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一生物科技有限公司；H6-1微型電泳槽 上海精益有機玻璃制品儀器廠；FR980凝膠成像系統(tǒng) 上海復日科技有限公司；SMA4000微量分光光度計 美林恒通儀器有限公司；StepOne型熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國應用生物系統(tǒng)公司；PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將保存在-80 ℃的甘油保藏管接種到裝有30 mL種子液的250 mL三角瓶中，230 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)16 h，然后將其接種于相同種子液中連續(xù)活化3 次備用。

1.3.2 搖瓶培養(yǎng)

將種子液以3%的接種量接到含有30 mL種子液的250 mL三角瓶中，230 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)（68±2）h進行搖瓶培養(yǎng)。

1.3.3 活菌總數(shù)及芽孢數(shù)測定

活菌總數(shù)測定：采用稀釋涂布平板計數(shù)法。將樣品用0.85%無菌生理鹽水逐級稀釋到10-5、10-6、10-7倍，分別取100 μL稀釋液均勻涂布在平板上，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)48 h后觀察計數(shù)。

芽孢數(shù)測定：將樣品放入80 ℃水浴10 min[21]，然后立即將樣品置于冰水中冷卻至40 ℃左右，參照活菌計數(shù)法進行涂布和培養(yǎng)操作，于37 ℃的恒溫培養(yǎng)4～5 d后觀察計數(shù)。

1.3.4 碳酸鈣對芽孢形成的影響

1.3.4.1 碳酸鈣添加時間、添加量及培養(yǎng)溫度對芽孢形成的影響

通過考察碳酸鈣不同添加時間（0、8、16、24、32 h），不同添加量（4%、5%、6%、7%、8%），及碳酸鈣添加情況下不同溫度培養(yǎng)（35、37、40、45、50 ℃）芽孢形成情況，研究添加碳酸鈣對凝結芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢形成的影響。

1.3.4.2 碳酸鈣對培養(yǎng)過程pH值的影響

將搖瓶培養(yǎng)至16 h，處理組添加6%的碳酸鈣，以未加碳酸鈣為對照組，每隔4 h測定培養(yǎng)基中pH值的變化，考察添加碳酸鈣對培養(yǎng)過程pH值的影響。

1.3.5 芽孢抗逆性測定[22]

在5 mL離心管中加入4 mL已有芽孢形成的培養(yǎng)液，置于80 ℃水浴10 min滅活營養(yǎng)細胞，用PBS清洗3 次后加入等體積PBS，4 ℃保藏備用。芽孢存活率按下式計算：

1.3.5.1 溫度對芽孢抗性的影響

取制備好的芽孢懸浮液2 mL，分別放置于85、90、95、100 ℃水浴10 min，冷卻后采用稀釋涂布平板計數(shù)法測定存活芽孢數(shù)，以未經(jīng)溫度處理的芽孢懸浮液作為對照。

1.3.5.2 pH值對芽孢抗性的影響

取制備好的芽孢懸浮液2 mL，5 000 r/min離心5 min棄上清液，分別加入2 mL pH 1.5、2.0、3.0、4.0的PBS，混勻37 ℃處理1 h和2 h后采用稀釋涂布平板法測定存活芽孢數(shù)，以pH 7.4的PBS中芽孢懸浮液作為對照。

1.3.5.3 膽鹽對芽孢抗性的影響

將制備好的芽孢懸浮液取2 mL，5 000 r/min離心5 min去上清液，分別加入2 mL膽鹽質量分數(shù)為0.03%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%的PBS，37 ℃孵育2 h后采用稀釋涂布平板法測定存活芽孢數(shù)，以無膽鹽的PBS處理為空白對照組。

1.3.6 real-time PCR檢測目的基因轉錄水平

根據(jù)NCBI中凝結芽孢桿菌kinC（Gene ID：29813636）、kinE（Gene ID：29812950）、spo0A（Gene ID：29813832）和內(nèi)參基因GAPDH（Gene ID：29813473）序列，設計并合成引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 目的基因及GAPDH引物Table 1 Primers for target genes and GAPDH

參照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取總RNA。參照第一鏈cDNA合成試劑盒的使用方法，在PCR儀上進行反轉錄反應，合成cDNA產(chǎn)物。以此為基礎，進行real-time PCR，反應體系為：20 μL的總體系中加入2×SG Fast qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.4 μL，超純水7.2 μL，模板cDNA 2 μL。PCR循環(huán)條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，45 次循環(huán)。使用StepOne型熒光定量PCR儀進行反應。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖表采用Origin軟件進行繪制。采用Duncan新復極差法進行多重比較，數(shù)據(jù)通過SPSS（Version 17.0）軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 添加碳酸鈣對芽孢形成的影響

2.1.1 碳酸鈣添加時間對芽孢形成的影響

在凝結芽孢桿菌CGMCC 9951培養(yǎng)到0、8、16、24、32 h，分別向盛有30 mL發(fā)酵液的250 mL三角瓶中添加6%的碳酸鈣，研究其對凝結芽孢桿菌芽孢形成的影響。由圖1可知，碳酸鈣添加時間對芽孢形成的促進作用差異極顯著（P＜0.01），在16 h添加碳酸鈣對芽孢形成的促進效果最好，芽孢形成量達4.05×106CFU/mL。進一步分析發(fā)現(xiàn)，該菌在12～16 h菌體生長逐漸進入穩(wěn)定期（圖2），因此在該時期加入碳酸鈣既不影響細胞的生長繁殖，又有利于促進芽孢的形成。

圖1 碳酸鈣添加時間對凝結芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢形成的影響Fig. 1 Effect of CaCO3 addition time on sporulation of B. coagulans CGMCC 9951

圖2 凝結芽孢桿菌CGMCC 9951生長曲線Fig. 2 Growth curve of B. coagulans CGMCC 9951

2.1.2 碳酸鈣添加量對芽孢形成的影響

圖3 碳酸鈣添加量對凝結芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢形成的影響Fig. 3 Effect of CaCO3 concentration on sporulation of B. coagulans CGMCC 9951

如圖3所示，未添加碳酸鈣組，在7 d后幾乎觀察不到芽孢的存在，碳酸鈣添加對芽孢形成量卻具有顯著影響，且在一定范圍內(nèi)隨著碳酸鈣添加量的增加，芽孢形成量逐漸增加，當添加量為6%時芽孢形成量達到最大2.16×107CFU/mL，隨著碳酸鈣添加量的進一步增加，芽孢形成量開始逐漸下降。

2.1.3 培養(yǎng)溫度對芽孢形成的影響

圖4 培養(yǎng)溫度對凝結芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢形成的影響Fig. 4 Effect of temperature on sporulation of B. coagulans CGMCC 9951

溫度是誘導芽孢形成的重要環(huán)境因子[23-24]。CGMCC 9951在37 ℃培養(yǎng)16 h后，將培養(yǎng)溫度分別調(diào)整到35、40、45、50 ℃，研究在有無碳酸鈣添加情況下溫度對CGMCC 9951芽孢形成的影響。結果發(fā)現(xiàn)在無碳酸鈣添加情況下，不同培養(yǎng)溫度對凝結芽孢桿菌芽孢的形成時間和形成量的影響差異顯著（P＜0.05）（圖4A），在40 ℃以下時，培養(yǎng)至7 d 仍無芽孢形成；而當培養(yǎng)溫度達到為45 ℃時，培養(yǎng)3 d即可產(chǎn)生芽孢，當培養(yǎng)溫度達到50 ℃時，培養(yǎng)7 d，芽孢形成量最大，可達到4.56×106CFU/mL。但在相同培養(yǎng)基中添加6%碳酸鈣，培養(yǎng)至3 d時，各溫度處理均能觀察到芽孢的形成，且37 ℃處理組中芽孢數(shù)最大，可達4.53×107CFU/mL（圖4B）；隨著溫度的進一步升高，發(fā)酵液蒸發(fā)量顯著增加，黏度激劇上升，水分活度降低，反而影響芽孢形成。

2.1.4 添加碳酸鈣對培養(yǎng)基pH值的影響

碳酸鈣可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，而pH值環(huán)境對芽孢形成及活性具有顯著影響。由圖5A可知，16 h添加6%的碳酸鈣可使培養(yǎng)基pH值從4快速上升到5.94，在18 h，pH值達到6.48時即可觀察到芽孢形成，20 h后培養(yǎng)基pH值開始繼續(xù)緩慢上升。而對照組培養(yǎng)至172 h，pH值才達到芽孢化啟動中性偏堿環(huán)境。碳酸鈣添加組，在70 h培養(yǎng)結束后pH值逐漸升高至8.18，鏡檢觀察芽孢形成達到最大時，稀釋涂布芽孢數(shù)為4.53×107CFU/mL。而無碳酸鈣添加組在220 h時pH值為8.53（圖5B），此時芽孢達到最大1.89×107CFU/mL。本研究結果顯示碳酸鈣加入能快速改善環(huán)境pH值條件，有效縮短芽孢形成時間，增加芽孢形成量。

圖5 碳酸鈣添加對培養(yǎng)基pH值的影響Fig. 5 Effect of CaCO3 concentration on pH of medium

2.2 添加碳酸鈣對芽孢抗逆性的影響

理想的益生菌須具備較強抗逆性和繁殖能力，以抵抗嚴酷的生產(chǎn)加工過程以及動物體內(nèi)的低酸和高膽鹽環(huán)境。上述研究發(fā)現(xiàn)碳酸鈣添加不僅可促進芽孢形成提前，且促孢效果明顯，但該條件下所形成芽孢的抗逆性及是否會影響其作為益生菌使用仍需探究。為此，研究溫度、pH值、膽鹽對CGMCC 9951芽孢活性的影響。如圖6所示，該菌在碳酸鈣添加條件下形成的芽孢，經(jīng)過95 ℃水浴10 min后，芽孢存活率仍能高達81.25%。

圖6 溫度對凝結芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢活性的影響Fig. 6 Effect of temperature on spore activity of B. coagulans CGMCC 9951

胃酸環(huán)境是益生菌進入體內(nèi)必須經(jīng)歷的一個關鍵過程，其酸耐受能力嚴重影響益生特性發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)在碳酸鈣添加條件下形成的芽孢具有良好的耐酸性能，而在pH 3.0處理2 h后的芽孢萌發(fā)率仍達到76.79%；同時還觀察到，酸處理該芽孢還可促進其快速萌發(fā)（表2）。在相同條件下，經(jīng)酸處理和未經(jīng)處理的芽孢萌發(fā)情況出現(xiàn)明顯差異，酸處理后的芽孢其萌發(fā)速度明顯高于對照組，在pH 3.0處理1 h時，芽孢萌發(fā)率是對照組的1.18 倍，pH 4.0處理1 h后芽孢萌發(fā)率是對照組的1.5 倍，pH 4.0處理2 h后的其萌發(fā)率仍然達到對照組的1.48 倍。

表2 凝結芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢在酸處理后的萌發(fā)情況Table 2 Germination rate of B. coagulans CGMCC 9951 spores under acidic conditions

圖7 膽鹽對凝結芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢活性的影響Fig. 7 Effect of bile salt concentration on spore activity of B. coagulans CGMCC 9951

研究發(fā)現(xiàn)，CGMCC 9951在碳酸鈣添加情況下形成的芽孢，表現(xiàn)出較強的膽鹽耐受能力，其在0.3%膽鹽中處理2 h后保持99.79%的高芽孢存活率，即使在0.7%膽鹽條件下，芽孢存活率仍高達87.22%（圖7）。

2.3 碳酸鈣對啟動芽孢形成相關基因的影響

圖8 碳酸鈣對芽孢化啟動關鍵基因相對表達量的影響Fig. 8 Effect of CaCO3 on the relative expression levels of key genes involved in sporulation initiation

通過對GenBank中凝結芽孢桿菌DSM 1、S-lac、HM-08、BC-HY1、2-6、36D1、B4098、GED7749B等全基因組數(shù)據(jù)，以及本研究所用的CGMCC 9951誘導芽孢前后轉錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，凝結芽孢桿菌中僅發(fā)現(xiàn)了2 個可激活芽孢化啟動蛋白Spo0A的組氨酸激酶，分別為KinC和KinE。凝結芽孢桿菌中kinC和kinE是否能在碳酸鈣添加下大量表達，并激活Spo0A且達到芽孢化啟動所需閾值，從而啟動CGMCC 9951的芽孢化過程是揭示碳酸鈣誘導芽孢化啟動機制的關鍵。以凝結芽孢桿菌ATCC 7050TkinC、kinE和spo0A基因序列為基礎，設計相關引物，在碳酸鈣添加情況下，對上述基因進行real-time PCR分析，研究碳酸鈣添加對kinC、kinE、spo0A表達的影響。結果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)16 h添加碳酸鈣后的2～4 h，kinC、kinE、spo0A的轉錄水平比未添加碳酸鈣組轉錄水平顯著升高。18 h和20 h，kinC的相對表達量分別為對照組的2.20 倍和61.07 倍，kinE的相對表達量分別為對照組的6.63 倍和23.49 倍，spo0A的相對表達量分別為對照組的3.71 倍和17.32 倍。由此可見，碳酸鈣的添加，改變環(huán)境pH值條件，這種變化可能通過某種途徑激活了kinC、kinE的大量表達，從而對Spo0A進行磷酸化并保持在較高水平，進而誘導芽孢化啟動進程。

3 討論與結論

芽孢桿菌芽孢的形成主要受惡劣生存環(huán)境的影響，有研究證實大多芽孢桿菌芽孢化啟動均是在中性偏堿環(huán)境下進行[25]，而酸性條件則不利于芽孢起始[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，37 ℃條件下6%的碳酸鈣在培養(yǎng)16 h添加能有效改善環(huán)境pH值，極大促進凝結芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢的產(chǎn)生。Dawes等[27]報道枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis 168）芽孢形成最適pH值為6.5～7.8，且在該范圍內(nèi)芽孢形成量恒定。Mazas等[28]報道蠟狀芽孢桿菌ATCC 7004、4342和9818芽孢形成的最適pH值為7.0，芽孢形成率均在90%左右，且在pH 6.5～8.3均能獲得良好的芽孢產(chǎn)量，而在最適pH值范圍外pH值升高或降低，細胞生長和芽孢形成量均會降低。研究還發(fā)現(xiàn)，過量碳酸鈣添加將導致發(fā)酵液pH值快速上升，這不僅影響菌體的正常生長代謝過程，而且超過了芽孢起始最適pH值范圍，從而影響了芽孢形成。因此適量碳酸鈣添加，有利于維持芽孢化啟動環(huán)境形成，從而更好促進芽孢大量啟動，縮短芽孢形成進程。

Moeller等[17]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢形成介質的組成影響芽孢對某些脅迫的抗性，在芽孢形成培養(yǎng)基中添加半胱氨酸、胱氨酸或硫脯氨酸制備的枯草芽孢桿菌芽孢對過氧化氫（H2O2）和環(huán)境相關的紫外線輻射（290～400 nm）的抗性高于用脯氨酸制備的芽孢或不加任何添加劑的芽孢。同時，Olivier等[18]證明解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、耐熱芽孢桿菌在高溫培養(yǎng)下形成的芽孢比較低溫度下形成的芽孢耐熱性能更強；而在培養(yǎng)基中添加礦物質離子（Ca2+、Mn2+、Mg2+）形成的芽孢耐熱性能增加的同時降低了抗壓性能。凝結芽孢桿菌CGMCC 9951在碳酸鈣刺激下形成的芽孢在95 ℃存活率達81.25%，該特點能滿足益生菌制劑生產(chǎn)中高溫擠壓成型的要求，可有效保持高的益生菌活性；同時CGMCC 9951在碳酸鈣刺激下形成的芽孢還表現(xiàn)出良好的耐酸性能，且酸環(huán)境刺激可加速其萌發(fā)，這為其益生特性發(fā)揮奠定了良好基礎。膽鹽是由肝細胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或牛磺酸結合而形成的鈉鹽或鉀鹽，它主要參與脂肪的消化與吸收，腸道中的膽鹽質量分數(shù)為0.03%～0.3%[6]。本實驗條件下所獲得的CGMCC 9951芽孢能夠在0.03%～0.3%膽鹽中幾乎全部存活，使其較快適應腸道環(huán)境，快速存活繁殖發(fā)揮益生作用。

眾所周知，芽孢形成是一個耗能和耗時的過程，當菌體處于營養(yǎng)饑餓狀態(tài)，細胞亞群間可能會優(yōu)先選擇向胞外釋放毒素蛋白進行相互殘殺，并利用被殘殺的細胞釋放物作為自身生長和細胞維持所需要的物質，而非立即啟動芽孢化進程[29-30]。對枯草芽孢桿菌芽孢化啟動過程研究發(fā)現(xiàn)，KinA、KinB、KinC、KinD和KinE蛋白激酶均可通過磷酸中繼轉移系統(tǒng)激活芽孢化啟動蛋白Spo0A。在對數(shù)生長末期和穩(wěn)定期早期，主要為kinC、kinD、kinE表達，它們的產(chǎn)物可激活產(chǎn)生低濃度的Spo0A-P，而低濃度的Spo0A-P利于菌體生物膜的形成；在穩(wěn)定期后，kinA和kinB則大量表達，并激活產(chǎn)生大量的Spo0A-P，當Spo0A-P積累達到一定閾值后，菌體便啟動芽孢化進程[29]。因此，KinA和KinB被認為是激活Spo0A磷酸化并啟動芽孢化最主要組氨酸激酶，Trach等[25]甚至認為在缺乏kinA和kinB的菌株中幾乎觀察不到芽孢的形成。然而項目組研究卻發(fā)現(xiàn)，當在對數(shù)生長末期向培養(yǎng)基中添加一定量的碳酸鈣，能將kinC相對表達量提高到61.07 倍，kinE的相對表達量提高到23.49 倍，并誘發(fā)大量芽孢的形成，芽孢形成數(shù)量達到108CFU/mL以上。Ledeaux等[31-32]也發(fā)現(xiàn)在kinA和kinB雙缺失的枯草芽孢桿菌中，kinC的大量表達可誘導芽孢形成，同時其還可繞過spo0F和spo0B通過旁路途徑直接激活Spo0A，且KinC和KinE對Spo0F具有很強的親和力[29]。

分析發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌中的KinC和KinE，除C端催化區(qū)域比較保守外，N端信號感受區(qū)結構卻明顯不同。KinC在枯草芽孢桿菌中由428 個氨基酸組成，由N端3 個跨膜區(qū)將其錨定在細胞膜上，并通過N端序列感知刺激信號；而凝結芽孢桿菌中的KinC由358 個氨基酸組成，與枯草芽孢桿菌的KinC同源性僅為42.4%，且未發(fā)現(xiàn)可能的跨膜區(qū)域，說明其可能是以游離的形式存在胞質中，并通過N端序列感知刺激信號?？莶菅挎邨U菌中KinE由738 個氨基酸構成，其N端含有2 個PAS（Per ARNT Sim）結構域，而凝結芽孢桿菌中的KinE則由504 個氨基酸構成，與枯草芽孢桿菌同源性僅為50.64%，且N端僅含有1 個PAS結構域。因此，凝結芽孢桿菌中如何感知細胞內(nèi)外環(huán)境變化而啟動kinC和kinE轉錄和表達，而KinC和KinE是通過識別何種因子或與配基結合而被激活發(fā)生自磷酸化，隨后通過何種途徑激活Spo0A并啟動芽孢化是本研究將持續(xù)關注問題。

此外，對CGMCC 9951中KinC和KinE兩個激酶及芽孢啟動主要調(diào)控因子Spo0A的表達量進行研究發(fā)現(xiàn)，在碳酸鈣加入4 h后，芽孢形成基因kinC、kinE、spo0A的相對表達量顯著提高，且kinC相對表達量是kinE的2.6 倍，kinC在凝結芽孢桿菌CGMCC 9951芽孢化啟動中是否承擔著主要作用，同時碳酸鈣的添加在改變pH值環(huán)境以及提供大量芽孢耐受性相關吡啶二羧酸鈣的同時，是否影響胞內(nèi)鈣庫水平，進而引起鈣信號相關級聯(lián)反應存在，都將是本研究在后續(xù)的工作中持續(xù)關注的問題。