孔 藝 蔣永和 劉 媛 林莉莉 陳阿麗

1. 廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510080；2.廣州市東升醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州 510140；3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510515；4.廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東 廣州 510006

溪黃草為2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中記載的唇形科植物線紋香茶菜Isodonstriatus(Benth.)Kudo或溪黃草Isodonsorra(Maxim.)Kudo的干燥地上部分[1]。溪黃草具有清熱解毒、涼血散瘀、利濕退黃等功效[2]，主要應(yīng)用于治療濕熱瀉痢，跌打瘀腫，急性黃疸型肝炎，急性膽囊炎等疾病，臨床療效確切[3]。

近年來(lái)，關(guān)于溪黃草體外抗腫瘤活性研究較多[4-12]。溪黃草水提物以時(shí)間依賴(lài)的方式抑制肝癌細(xì)胞HepG2的體外增殖[4]，溪黃草醇提物在體外可分別抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[11]，但尚未見(jiàn)關(guān)于兩者抗腫瘤活性差異的研究。另一方面，中醫(yī)理論認(rèn)為溪黃草具有保肝利膽的作用，研究也表明溪黃草提取物可抑制肝癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。目前尚未見(jiàn)關(guān)于溪黃草不同提取物對(duì)人肝癌HepG2、胃癌 MKN-45和食管癌TE-1細(xì)胞株增殖影響的對(duì)比研究，其提取物對(duì)其他消化道腫瘤是否也具有體外抗腫瘤活性有待研究。本研究采用水和乙醇兩種不同的溶劑對(duì)溪黃草進(jìn)行提取，比較其水提物和醇提物的色譜圖差異，并在體外檢測(cè)其對(duì)HepG2、MKN-45和TE-1細(xì)胞株增殖的影響，旨在為進(jìn)一步研究溪黃草在肝癌、胃癌和食管癌中具有體外抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 溪黃草(批號(hào)171001、171002、171003)由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司溪黃草基地提供，經(jīng)廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院田素英高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為溪黃草R.serra(Maxim)Hara。人肝癌細(xì)胞HepG2和人胃癌細(xì)胞MKN-45由廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院蔡祥勝博士饋贈(zèng)，人食管癌細(xì)胞株TE-1由廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院劉乃華博士饋贈(zèng)。甲醇和甲酸(色譜純，F(xiàn)isher公司)。DMEM培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素、胎牛血清和胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。DMSO(細(xì)胞用無(wú)菌級(jí))和噻唑藍(lán)粉末(Methylthiazolyldiphenyl-Terazolium Bromide,MTT)購(gòu)自sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀(包括Waters2695分離單元、2996型二極管陣列檢測(cè)器、2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，美國(guó)Waters公司)。sartorius電子天平(廣州靚恒科學(xué)儀器有限公司)；N-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì)社)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)A-sheville NC公司)；GB-Ⅱ超凈工作臺(tái)；Multiscan-GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溪黃草水提物的制備 稱(chēng)取溪黃草粗粉100 g，加入10倍量的蒸餾水浸泡1 h，水煎提取1 h，趁熱過(guò)濾藥液，再重復(fù)提取3次，合并濾液，60 ℃恒溫減壓濃縮至50 mL。將濃縮后的溪黃草提取物放于-80 ℃冰箱中預(yù)凍12 h，置于真空冷凍干燥機(jī)低溫升華干燥48 h后，密封保存于-20 ℃。使用時(shí)，40 mg溪黃草凍干粉加入細(xì)胞高糖培養(yǎng)基，超聲至完全溶解并定容為10 mL，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 溪黃草乙醇提取物的制備 稱(chēng)取溪黃草粗粉100 g，加入10倍量60%乙醇浸泡1 h，回流提取1 h，趁熱過(guò)濾藥液，再重復(fù)提取3次，合并濾液，60 ℃恒溫減壓濃縮至50 mL。將濃縮后的溪黃草提取物放于-80 ℃冰箱中預(yù)凍12 h，置于真空冷凍干燥機(jī)低溫升華干燥48 h后，密封保存于-20 ℃。使用時(shí)，400 g溪黃草凍干粉加入DMSO，超聲至完全溶解并定容為1 mL，存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 高效液相色譜條件 Waters C18色譜柱(250 mm×4.60 mm,5 μm)；流動(dòng)相:甲醇(A)-0.1%甲酸(B)梯度洗脫(0～38 min，40%A；38～42 min，40%～55%A；42～63 min，55%～60%A)；流速：0.7 mL/min；波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。各取溪黃草水提物和醇提物50.0 mg，置10 mL容量瓶，加60%乙醇，超聲30 min，補(bǔ)足60%乙醇至刻度。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2，人胃癌細(xì)胞株MKN-45和人食管癌細(xì)胞株TE-1細(xì)胞用含10 %胎牛血清和1 %青霉素-鏈霉素溶液的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于含5% CO2、溫度為37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱，隔天換液。

1.3.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2、MKN-45和TE-1細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，過(guò)夜培養(yǎng)后細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為溪黃草水提物和醇提物兩組，分別向三種細(xì)胞株加入不同質(zhì)量濃度的溪黃草水提物溶液(0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、2.5和3 mg/mL)或溪黃草醇提物溶液(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.5和2 mg/mL)進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零孔(向未接種細(xì)胞的培養(yǎng)孔中加入200 μL/孔 DMEM完全培養(yǎng)基)、陰性對(duì)照組(向含有細(xì)胞的培養(yǎng)孔中加入200 μL/每孔 DMEM完全培養(yǎng)基)和溶劑對(duì)照組(向含有細(xì)胞的培養(yǎng)孔中加入200 μL/每孔 含0.05 % DMSO的DMEM完全培養(yǎng)基，僅用于醇提物組)。培養(yǎng)48 h后，棄去原有含藥培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL 的MTT溶液，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去MTT溶液，每孔加入150 μL DMSO，放置于搖床上，避光震蕩10 min。在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度(A)值(測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm)。本實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，采用圖表分析軟件GraphPad Prism 5.0計(jì)算分析各組IC50值。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD570/對(duì)照組OD570)×100%

2 結(jié)果

2.1 溪黃草水提物和醇提物色譜圖比較 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版”，對(duì)溪黃草水提取物與醇提取物色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1所示。醇提物與水提物相比，新增6個(gè)峰，分別為圖1中的3號(hào)峰(27.0 min)、6號(hào)峰(45.6 min)、10號(hào)峰(50.3 min)、11號(hào)峰(52.6 min)、12號(hào)峰(56.3 min)和13號(hào)峰(59.6 min)。缺失4個(gè)峰，分別為2號(hào)峰(20.2 min)、4號(hào)峰(28.7 min)、8號(hào)峰(46.9 min)和9號(hào)峰(48.8 min)。

溪黃草不同提取物色譜圖除色譜峰數(shù)目不同外，峰面積也不同(見(jiàn)表1)。這充分說(shuō)明不同的提取溶劑使溪黃草的化學(xué)成分在質(zhì)和量上發(fā)生明顯的變化。

圖1 溪黃草不同提取物色譜圖

表1 溪黃草水提物和醇提物色譜圖峰結(jié)果

2.2 溪黃草水提物和醇提物均可抑制細(xì)胞的增殖 溪黃草水提物和醇提物在HepG2、MKN-45和TE-1細(xì)胞株中的IC50值見(jiàn)表2。溪黃草水提物可抑制HepG2、MKN-45和TE-1的細(xì)胞增殖，且抑制作用在上述3株細(xì)胞之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，溪黃草醇提物對(duì)以上3種細(xì)胞株的增殖也具有抑制作用，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但重要的是，溪黃草水提物和醇提物對(duì)每種細(xì)胞株的增殖抑制作用均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且溪黃草醇提物的IC50值顯著小于水提物，說(shuō)明溪黃草醇提物對(duì)3種不同細(xì)胞株的增殖抑制作用顯著強(qiáng)于水提物。

表2 溪黃草不同提取物對(duì)不同細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

4 討論

溪黃草的化學(xué)成分較多，藥效成分復(fù)雜。截止到2016年，從溪黃草各基源植物中已分離鑒定了近300種化合物，主要為揮發(fā)油類(lèi)、萜類(lèi)、多酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、神經(jīng)酰胺類(lèi)化合物及木脂素、甾醇、活性多糖等成分[13-19]。近來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)溪黃草水煎劑具有抗肝癌活性[4,20]，并證實(shí)溪黃草黃酮是溪黃草重要的藥理活性成分之一，存在于溪黃草水溶性總黃酮部位[20]。此外，張慕垚等[11]發(fā)現(xiàn)溪黃草乙醇提取物通過(guò)下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)促癌性小RNA miR-1290的表達(dá)和分泌，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。林戀竹[12]對(duì)比溪黃草葉和莖乙醇提取物的HPLC圖譜，得出全草入藥的科學(xué)性，并揭示二萜類(lèi)化合物是溪黃草乙醇提取物呈現(xiàn)抑菌及抗腫瘤活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究采用水和乙醇對(duì)溪黃草全草進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)其水提物和醇提物可分別抑制HepG2、MKN-45和TE-1細(xì)胞株的增殖。

本研究中溪黃草水提物抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖的IC50值為(2.05±0.19)mg/mL。馮傳平等[20]的研究表明當(dāng)加入0.5 mg/mL溪黃草水溶性總黃酮作用HepG2細(xì)胞株48后h，對(duì)細(xì)胞增殖抑制率為(34.92±2.31)%，與本研究結(jié)果相近。同時(shí)水提物也可抑制MKN-45和TE-1細(xì)胞株的增殖，且抑制作用在三株細(xì)胞之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本課題組采用醇提物進(jìn)行研究也得出相同的結(jié)論。但值得注意的是，醇提物對(duì)HepG2、MKN-45和TE-1細(xì)胞株的增殖抑制作用顯著強(qiáng)于水提物。在我國(guó)，中藥藥的服用方法多以水煎為主。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)溪黃草醇提物具有良好的體外抗腫瘤活性，為進(jìn)一步探尋其在HepG2、MKN-45和TE-1細(xì)胞株中具有抑制細(xì)胞增殖活性的化合物提供研究方向。

本研究仍有不足之處，如尚未研究溪黃草提取物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響及可能的機(jī)制，以及是否具有體內(nèi)抗腫瘤活性。其次，未檢測(cè)溪黃草不同提取物不同批次之間的色譜圖差異。課題組后續(xù)將繼續(xù)深入研究，并進(jìn)一步揭示不同的提取方法對(duì)溪黃草抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)的提取效率，闡明物質(zhì)組成差異，尋找溪黃草醇提物中抗腫瘤活性較強(qiáng)的化學(xué)成分。