三種滇西地區(qū)藥用黃芩屬植物與正品黃芩抗菌活性研究

刁紅梅 吳秀蓉 肖朝江 姜 北

大理大學(xué)藥物研究所，云南 大理 671000

黃芩屬(ScutellariaLinn.)植物種類繁多，部分有藥用記載，多用于清熱解毒、抗菌消炎[1]，其中黃芩(Scutellariabaicalensis)作為正品中藥材主要分布在東北、華北、西北地區(qū)東部[1]。在上述地區(qū)之外，一些當(dāng)?shù)胤植嫉狞S芩屬植物也常作為黃芩代用品藥用，特別是西南地區(qū)黃芩屬植物種類多、資源豐富，黃芩代用品現(xiàn)象更加常見(jiàn)，如滇黃芩(S.amoena)在《滇南本草》中便明確可以代黃芩藥用。在云南滇西地區(qū)，當(dāng)?shù)丶{西族、彝族、白族等少數(shù)民族也有用滇黃芩(S.amoena)(白語(yǔ)亦稱作“黃芩”)、麗江黃芩(S.likiangensis)(納西語(yǔ)“shidailaiki”)、半枝蓮(S.barbata)(白語(yǔ)“奢每粗”)等代替正品黃芩藥用的傳統(tǒng)[1]。根據(jù)《中國(guó)植物志》，黃芩、滇黃芩、麗江黃芩均為黃芩屬黃芩亞屬頂序黃芩組狹葉黃芩亞組植物[1]，在植物分類學(xué)上具有較高的近緣性與相似度，因此滇黃芩、麗江黃芩作為黃芩的代用品具有一定的植物分類學(xué)基礎(chǔ)，但半枝蓮在植物分類學(xué)上與黃芩相隔較遠(yuǎn)[1]，因此，是否可以代用存在一定的疑問(wèn)。另一方面，黃芩屬植物資源雖然十分豐富，但現(xiàn)代研究常限于幾種常見(jiàn)的藥用植物，許多代用品在化學(xué)成分、藥理藥效方面研究很少，因此，無(wú)法系統(tǒng)評(píng)估這些植物潛在的應(yīng)用價(jià)值與替代黃芩藥用的合理性。為此，本課題對(duì)采自滇西地區(qū)三種常見(jiàn)黃芩屬藥用植物滇黃芩、麗江黃芩、半枝蓮以及市售正品中藥材黃芩進(jìn)行了抗菌活性對(duì)比性研究，為認(rèn)識(shí)這幾種黃芩屬植物與黃芩替代使用可行性、科學(xué)合理地開(kāi)發(fā)滇西黃芩屬植物資源提供初步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品 滇黃芩、半枝蓮植物樣品2019年7月采自云南省大理州洱源縣；麗江黃芩植物樣品2019年8月采自麗江玉龍縣。經(jīng)大理大學(xué)生藥學(xué)教研室張德全博士鑒定為滇黃芩(Scutellaria amoena C. H. Wright)、半枝蓮(Scutellaria barbata D. Don)和麗江黃芩(Scutellaria likiangensis Diels)。正品黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)2019年8月購(gòu)自大理市當(dāng)?shù)厮幍?。上述四種樣品的地下部分各約10 g，粉碎后分別以85%乙醇200 mL冷浸提取3次，每次24 h，再以超聲提取2次，每次30 min，合并提取液，減壓濃縮，凍干，分別得樣品粗提物凍干粉。

1.2 供試菌種 實(shí)驗(yàn)所用金黃色葡萄球菌(批號(hào)：ATCC 25923)、痢疾桿菌(批號(hào)：ATCC 25927)、大腸桿菌(批號(hào)：ATCC 25922)均由大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試劑與儀器 甲醇(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司，色譜純)，甲酸(天津市化學(xué)試劑三廠，分析純)，實(shí)驗(yàn)用水為哇哈哈純凈水。EL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，SB25-12 DTDN超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)，SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)基配制 LB液體培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基)：取100 mL去離子水，加入洗凈的攪拌子，置磁力攪拌機(jī)上，依次加入胰蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、NaCl 2 g，溶質(zhì)全部溶解后加去離子水至200 mL，轉(zhuǎn)入錐形瓶，封口。經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌鍋滅菌30 min，烘干后冷卻備用。LB固體培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基)：取100 mL去離子水，加入洗凈的攪拌子，置磁力攪拌機(jī)上，依次加入胰蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、NaCl 2 g、瓊脂粉4 g，攪拌均勻后加去離子水至200 mL，轉(zhuǎn)入錐形瓶，封口。經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌鍋滅菌30 min，烘干后冷卻至50～60℃，倒制平板。

1.4.2 菌液制備 在超凈工作臺(tái)上，將金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌以三區(qū)劃線法接種在相應(yīng)的LB固體平板上，每個(gè)菌種接種2個(gè)平板，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，挑取單個(gè)菌落置LB液體培養(yǎng)基中，置27℃搖床(160 rpm)培養(yǎng)6～8 h，菌液渾濁后以LB液體培養(yǎng)基稀釋10000倍，即成病原菌稀釋液(約為1.0×104 CFU/mL)。

1.4.3 供試品溶液配制 以上4種樣品粗提物各稱取24 mg，溶于6 mL無(wú)菌水中，以0.22 μm微孔濾膜除菌，將供試品配置成初始濃度為4 mg/mL儲(chǔ)備液，取儲(chǔ)備液，以無(wú)菌水系列稀釋。

1.4.4 實(shí)驗(yàn)操作 在滅菌96孔板上，每個(gè)樣品濃度平行加4個(gè)復(fù)孔，分別取50 μL供試品溶液及50 μL菌液混勻，使各孔最終體積為100 μL，同時(shí)做空白對(duì)照(50 μL LB液體培養(yǎng)基+50 μL菌懸液)、空白培養(yǎng)基對(duì)照(100 μL LB液體培養(yǎng)基)，將96孔板置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15～18 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD600 nm值。

供試品對(duì)大腸桿菌及痢疾桿菌的終濃度為：2.00、1.50、1.00、0.75、0.50 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的終濃度為：0.50、0.40、0.30、0.20、0.10 mg/mL。

根據(jù)OD600 nm值，計(jì)算各濃度下樣品對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制率，計(jì)算公式如下：

細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制率% =(空白對(duì)照OD600值 - 供試品OD600值)/空白對(duì)照OD600 值×100%

以樣品濃度為橫坐標(biāo)，各濃度下抑菌率的均值為縱坐標(biāo)繪制回歸曲線，根據(jù)回歸曲線計(jì)算當(dāng)抑制率為50%時(shí)的樣品濃度，即IC50值。

1.4.5 供試樣品HPLC分析 上述4種樣品粗提物各取30 mg，以2 mL色譜級(jí)甲醇超聲溶解，0.45 μm濾膜過(guò)濾，配制成濃度為15 mg/mL供試樣品溶液。HPLC分析條件為：分離柱為Agilent SN USCM052204 SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)；梯度洗脫：0～10 min，5%～25%(B)；10～90 min，25%～65%(B)；90～100 min，65%～100%(B)；100～105 min，100%(B)；柱溫30℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 四種供試黃芩屬植物樣品的抗菌活性 四種黃芩屬植物供試樣品對(duì)各菌種的生長(zhǎng)抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1、表2所示，四種黃芩屬植物對(duì)各菌種的生長(zhǎng)抑制率曲線如圖1所示。根據(jù)抗菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，四種黃芩屬植物供試樣品對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均有抑制作用。以IC50值為依據(jù)，各供試樣品對(duì)痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制活性明顯，對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用稍弱；同時(shí)，滇黃芩、麗江黃芩對(duì)痢疾桿菌的生長(zhǎng)抑制作用顯著優(yōu)于黃芩、半枝蓮?？傮w來(lái)看，三種滇西地區(qū)黃芩屬植物樣品抑菌活性優(yōu)于市售正品黃芩樣品。

表1 四種黃芩屬植物對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌的抑制率

表2 四種黃芩屬植物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率

(A)大腸桿菌；(B)痢疾桿菌；(C)金黃色葡萄球菌圖1 四種黃芩屬植物供試樣品對(duì)各菌種的生長(zhǎng)抑制曲線

2.2 四種供試黃芩屬植物樣品HPLC分析結(jié)果 四種黃芩屬植物樣品的HPLC分析結(jié)果如圖2所示。根據(jù)HPLC分析結(jié)果，滇黃芩與麗江黃芩的主要化學(xué)成分較為相似，僅在9號(hào)峰上兩者有一定的差異，顯示麗江黃芩的化學(xué)成分更具多樣性。同時(shí)滇黃芩與麗江黃芩的主要化學(xué)成分均較正品黃芩豐富，特別是含有正品黃芩中未見(jiàn)的3號(hào)峰，同時(shí)，5、6號(hào)峰的含量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正品黃芩，僅在7號(hào)峰上與正品黃芩有所不同。根據(jù)上述譜峰的UV譜圖(圖3)，3、5、6、7號(hào)峰具有十分相似的UV譜圖，顯示這些譜峰應(yīng)來(lái)自同一類型的黃芩屬植物所含有的黃酮類成分[2-7]，應(yīng)該是黃芩屬植物抗菌消炎等藥用功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，由此推斷滇黃芩與麗江黃可能具有較正品黃芩更好的功效與品質(zhì)。

HPLC分析結(jié)果顯示(圖2)，半枝蓮與其它三種黃芩屬植物樣品的主要成分組成有較大差異，相關(guān)譜峰的UV譜圖(圖3)也顯示其主成分9號(hào)峰與黃芩屬植物含有的黃酮類成分在結(jié)構(gòu)類型上有一定的差異，因此，半枝蓮在抗菌活性以及藥用記載上與滇黃芩、麗江黃芩等有所不同也屬合理。

圖2 四種黃芩屬植物供試樣品的HPLC譜圖(254 nm)

圖3 HPLC譜圖中幾個(gè)主要譜峰的UV譜圖

3 討論

黃芩屬植物我國(guó)南北均產(chǎn)，除正品黃芩(S.baicalensis)藥用外，據(jù)《新編中藥志》記載，另有甘肅黃芩(S.rehderiana)、粘毛黃芩(S.viscidula)、滇黃芩(S.amoena)、麗江黃芩(S.likiangensis)、連翹葉黃芩(川黃芩)(S.hypericifolia)等5種黃芩屬植物在各地亦做黃芩藥用。根據(jù)《中國(guó)植物志》，這5種黃芩屬植物外加正品黃芩均為黃芩屬黃芩亞屬頂序黃芩組狹葉黃芩亞組植物，應(yīng)該并非巧合。前人曾采用聚類分析[8]、主成分分析[9]、數(shù)量分類[10]等方法分析了正品黃芩與非正品黃芩間的關(guān)系，均證明這幾種黃芩屬植物與正品黃芩的親緣關(guān)系十分接[11-12]，因此這幾種黃芩代用品從植物分類學(xué)角度來(lái)看應(yīng)該具有一定的合理性，但在化學(xué)成分與藥理藥效學(xué)研究方面缺乏系統(tǒng)的研究報(bào)道。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，正品黃芩對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制活性[2-7]，為此，本研究特意選取這三種致病菌用以探討三種滇西地區(qū)黃芩屬植物與正品黃芩的抗菌活性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，滇黃芩與麗江黃芩化學(xué)成分最為相近，兩者對(duì)大腸桿菌以及痢疾桿菌的抑制活性也十分相似，均與滇黃芩與麗江黃芩在植物分類學(xué)上親緣關(guān)系最為接近完全吻合。滇黃芩、麗江黃芩較正品黃芩的化學(xué)成分更為豐富，含有正品黃芩中未見(jiàn)的3號(hào)峰，同時(shí)，5、6號(hào)峰的含量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正品黃芩，故滇黃芩、麗江黃芩的抑菌活性也往往優(yōu)于正品黃芩。而半枝蓮與其它幾種供試黃芩屬植物樣品的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)且化學(xué)成分相差較大，對(duì)幾種菌種的抑制活性也確實(shí)與滇黃芩、麗江黃芩不同，但半枝蓮卻仍表現(xiàn)出一定的抑菌活性，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究為基于傳統(tǒng)植物分類學(xué)尋找、開(kāi)發(fā)藥用植物資源、挖掘民族醫(yī)藥潛力提供了一個(gè)研究例證。

綜合而言，滇黃芩、麗江黃芩在抑菌活性方面優(yōu)于正品黃芩，且化學(xué)成分較正品黃芩類型相似、內(nèi)容更加豐富，初步證實(shí)了這幾種黃芩屬植物具有替代正品黃芩藥用的合理性。滇西地區(qū)黃芩屬植物資源豐富，本研究為深入認(rèn)識(shí)滇西地區(qū)黃芩屬植物品質(zhì)、科學(xué)合理地開(kāi)發(fā)滇西黃芩屬植物資源提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。