何宇寧,黃 和,2,*,鐘賽意,劉 海,秦小明

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東 湛江 524088;2.廣東省亞熱帶果蔬加工科技創(chuàng)新中心,廣東 湛江 524000)

菠蘿蜜(Artocarpus heterophyllus Lam.),俗稱大樹菠蘿,屬于?？?、菠蘿蜜屬的常青喬木。菠蘿蜜的果實(shí)柔軟可口,香氣撲鼻,是一種珍貴的熱帶水果[1]。研究表明,菠蘿果肉營(yíng)養(yǎng)豐富,富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、多酚、脂肪酸、維生素和礦物質(zhì),可作為一些重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的良好來源[2-3]。同時(shí),菠蘿蜜具有抗氧化、抗炎、抗菌、防齲、抗腫瘤和降血糖等多種生物活性[4-7]。目前菠蘿蜜種植業(yè)面臨的最大問題是其易腐性導(dǎo)致的巨大損失。因此,開發(fā)菠蘿蜜新產(chǎn)品,為栽培者創(chuàng)造更高的收益,具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義[8]。菠蘿蜜果實(shí)含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),其發(fā)酵產(chǎn)品也能很好的保存原有的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分[9]。

醋酸菌是可將乙醇氧化生成乙酸的一類細(xì)菌[10],也是世界釀醋工業(yè)的重要微生物[11]。醋酸菌不僅廣泛用于生產(chǎn)乙酸、葡萄糖酸、山梨酸以及合成必要的維生素如VC[12-14],還在生化反應(yīng)糖類和乙醇氧化的研究中扮演重要角色[15-16]。關(guān)于菠蘿蜜果醋發(fā)酵醋酸菌的選育研究相對(duì)較少,缺乏可參考數(shù)據(jù)。李文等[17]從獼猴桃中篩選出一株產(chǎn)酸量大和耐乙醇、耐高溫能力強(qiáng)的醋酸菌,可使醋酸產(chǎn)量提升30.54%。陳洋等[18]從醋醅中篩選出菌株FY4,在高乙醇體積分?jǐn)?shù)和高溫狀態(tài)下仍保持高產(chǎn)酸率,并成功用于熱帶水果的醋酸發(fā)酵。目前菠蘿蜜果醋的研究鮮見報(bào)道,同時(shí)缺乏菠蘿蜜果醋發(fā)酵的專用醋酸菌。

本研究通過菠蘿蜜自然發(fā)酵與菌種三級(jí)篩選、生理生化鑒定、16S rRNA基因序列分析,篩選出適合菠蘿蜜果醋發(fā)酵的醋酸菌;再通過發(fā)酵特性實(shí)驗(yàn),比較選育的菌株與商業(yè)菌株As1.41在高乙醇體積分?jǐn)?shù)和高溫條件下的產(chǎn)酸能力。最終選育出菠蘿蜜發(fā)酵果醋專用醋酸菌,提高菠蘿蜜果醋產(chǎn)酸量和品質(zhì),為菠蘿蜜果醋發(fā)酵提供優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

菠蘿蜜 廣東湛江市麻章區(qū)湖光鎮(zhèn)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);醋酸菌As1.41 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;安琪葡萄酒高活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司。

葡萄糖、酵母膏、瓊脂 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;結(jié)晶紫染液、番紅染液、碘液、95%乙醇、無水乙醇、酚酞指示劑、NaOH、CaCO3廣東光華科技股份有限公司;Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、San Prep柱式DNA膠回收試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;pUm-T載體試劑盒、dNTP 寶生物工程公司;GeneRuler DNA Ladder Mix Marker 賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖1.0%,酵母膏1.0%,pH值自然,121 ℃滅菌20 min,冷卻至70 ℃,加入體積分?jǐn)?shù)4.0%無水乙醇;碳酸鈣平板分離培養(yǎng)基:葡萄糖1.0%,酵母膏1.0%,CaCO32.0%、瓊脂1.5%,pH值自然,121 ℃滅菌20 min,冷卻至70 ℃,加入體積分?jǐn)?shù)4.0%無水乙醇;斜面保藏培養(yǎng)基:葡萄糖1.0%,酵母膏1.0%,瓊脂1.5%,pH值自然,121 ℃滅菌20 min,冷卻至70 ℃,加入體積分?jǐn)?shù)4.0%無水乙醇;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖2.0%,酵母膏1.0%,pH值自然,121 ℃滅菌20 min,冷卻至70 ℃,加入體積分?jǐn)?shù)4.0%無水乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;722s紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DYY-5電泳儀 北京六一儀器廠;3-18K高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Sigma公司;2720 Themalcyder聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;AUY120電子天平 日本島津制作所;SPX-250B-2生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菠蘿蜜果醋自然發(fā)酵醋醪制備

將新鮮菠蘿蜜果肉洗凈,勻漿后裝入己滅菌500 mL錐形瓶中,用4 層紗布封口,置于實(shí)驗(yàn)室陰暗處,室溫環(huán)境(25～30 ℃)自然發(fā)酵30 d,每隔5 d在無菌環(huán)境下取醋醪樣品待測(cè)。

1.3.2 菠蘿蜜果酒發(fā)酵液制備

參考張玲等[19]制備菠蘿蜜果酒的方法。選取新鮮菠蘿蜜,取果肉洗凈后切碎,在護(hù)色劑中浸泡20 min,取出果肉按料液比1∶1.5(g/mL)加入蒸餾水后勻漿,加入0.1 g/L焦亞硫酸鈉,混勻靜置2 h,加入0.5 g/L果膠酶,在30 ℃酶解3 h。酶解后的菠蘿蜜果漿用蔗糖調(diào)節(jié)糖度至200 mg/mL,用檸檬酸調(diào)節(jié)pH值至4.5,100 ℃滅菌7 min。待菠蘿蜜果漿冷卻后,以5%體積分?jǐn)?shù)接入活化酵母菌,28 ℃發(fā)酵6 d后,65 ℃巴氏滅菌30 min。

1.3.3 醋酸菌的篩選

1.3.3.1 菌種一級(jí)篩選

采用平板涂布分離法,取1 mL醋醪樣品稀釋至10-4～10-6,將稀釋液涂布在碳酸鈣平板分離培養(yǎng)基上,每個(gè)稀釋度進(jìn)行2 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn),在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后觀察現(xiàn)象,挑選長(zhǎng)勢(shì)良好,溶鈣圈大而清晰的單菌落,進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,篩選出革蘭氏陰性菌。

1.3.3.2 菌種二級(jí)篩選

將一級(jí)篩選的菌株各取1 環(huán),接種于100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)3 d,5 000 r/min離心10 min后取5 mL上清液用0.1 mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0,煮沸后加入4～5 滴FeCl3溶液,有紅褐色沉淀生成,表明為產(chǎn)醋酸細(xì)菌[20]。

1.3.3.3 菌種三級(jí)篩選

將二級(jí)篩選的菌株各取1 環(huán),接種于100 mL菠蘿蜜果酒中,30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)5 d,對(duì)發(fā)酵液的香氣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.4 醋酸菌生理生化實(shí)驗(yàn)

取篩選出的菌株和商業(yè)菌株As1.41進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)[21]。

1.3.5 醋酸桿菌的分子生物學(xué)鑒定

1.3.5.1 基因組提取

按照Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書要求,提取篩選得到的5 株醋酸桿菌基因組DNA作為模板DNA。

1.3.5.2 PCR擴(kuò)增

PCR引物:正向引物5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’,反向引物5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’;PCR反應(yīng)體系:模板DNA 1 μL,正向引物2 μL,反向引物2 μL,dNTP 2 μL,10×緩沖液5 μL,Taq(5 U/μL)0.5 μL,加入雙蒸水調(diào)節(jié)至50 μL;PCR反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火25 s,72 ℃延伸50 s,35 個(gè)循環(huán)。

1.3.5.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)

取5 μL PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,電泳參數(shù):150 V,100 mA,10～20 min,若膠體上形成清晰條帶,則PCR擴(kuò)增成功。

1.3.5.4 16S rRNA基因片段的測(cè)序及分析

委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序工作。利用BLAST程序在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)分析,選擇與目標(biāo)菌株有較高同源性的模式菌株[22],通過MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 醋酸菌發(fā)酵性能實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將篩選的醋酸桿菌各挑取1 環(huán)接種于100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng),每隔6 h用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度,以商業(yè)菌株As1.41為參照。

1.3.6.2 溫度對(duì)發(fā)酵性能的影響

將篩選的醋酸桿菌活化后分別取1 mL接入100 mL菠蘿蜜果酒發(fā)酵液中,乙醇體積分?jǐn)?shù)4.0%,分別在25、28、31、34、37 ℃,120 r/min振蕩培養(yǎng)96 h,測(cè)定醋酸桿菌產(chǎn)酸量、生長(zhǎng)量、醇酸轉(zhuǎn)化率,以商業(yè)菌株As1.41為參照。

1.3.6.3 乙醇對(duì)發(fā)酵性能的影響

將篩選的醋酸桿菌活化后分別取1 mL接入100 mL菠蘿蜜果酒發(fā)酵液中,乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%、8%、10%,30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)96 h,測(cè)定醋酸桿菌產(chǎn)酸量、生長(zhǎng)量、醇酸轉(zhuǎn)化率,以商業(yè)菌株As1.41為參照。

1.3.6.4 產(chǎn)酸量測(cè)定

參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》[23]方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6.5 醇酸轉(zhuǎn)化率測(cè)定

參考孫一帆等[24]方法,計(jì)算公式如下:

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和表格制作,采用Origin 2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)圖繪制,利用BLAST程序在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)16S rRNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,取其平均值進(jìn)行各數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌篩選

2.1.1 一級(jí)篩選

由表1可知,經(jīng)過72 h培養(yǎng)后有14 株菌有較小透明圈,31 株菌周圍都有明顯透明圈(圖1)。對(duì)這31 株菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,均為革蘭氏陰性菌(圖2)。

表1 一級(jí)篩選結(jié)果Table 1 Results of primary screening

圖1 平板培養(yǎng)基上菌落形態(tài)圖Fig. 1 Colony morphology on medium plates

圖2 菌株革蘭氏染色鏡檢圖（16×100）Fig. 2 Microscopic observation of bacterial strains after Gram staining (16 × 100)

2.1.2 二級(jí)篩選

表2 產(chǎn)酸定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Evaluation of acid production ability

由表2可知,一級(jí)篩選的31 株菌進(jìn)行產(chǎn)酸定性實(shí)驗(yàn)中,只有15 株菌生成紅褐色沉淀。

2.1.3 三級(jí)篩選

表3 發(fā)酵液感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Sensory evaluation of fermentation broths

由表3可知,二級(jí)篩選的活化醋酸菌經(jīng)過5 d連續(xù)發(fā)酵,15 瓶發(fā)酵液由于醋酸菌的不同,呈現(xiàn)出不同的氣味,有醋香味、菠蘿蜜果香味、餿臭味等,從中篩選出5 株產(chǎn)醋香和菠蘿蜜果香的醋酸菌用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 生理生化實(shí)驗(yàn)

表4 菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of physiological and biochemical tests of acetic acid bacteria

根據(jù)表4和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[21]的描述,初步判斷篩選出的5 株疑似醋酸菌Aa723、Aa747、Aa844、Aa847和Aa941均屬于醋酸桿菌屬。

2.3 16S rRNA鑒定

圖3 醋酸桿菌16S rRNA的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of 16S rRNA genes from selected strains

由圖3可知,5 株醋酸桿菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小約為1 500 bp,且條帶清澈無彌散,說明PCR擴(kuò)增成功,可進(jìn)行下一步的16S rRNA基因片段測(cè)序。

圖4 醋酸桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of acetic acid bacteria

由圖4可知,5 株醋酸桿菌在系統(tǒng)發(fā)育樹中屬于4 個(gè)不同的種。通過bookstrap檢驗(yàn)1 000 次支持該進(jìn)化樹分支可信度,綜合各菌株的生理生化特征和形態(tài)學(xué)結(jié)果,可以確定5 株醋酸桿菌:Aa723和Aa941為巴氏醋酸桿菌(A. pasteurianus),Aa847為法布拉姆醋酸桿菌(A. fabarum),Aa747為熱帶醋酸桿菌(A. tropicalis),Aa844為醋化醋酸桿菌(A. aceti)。其中篩選出的A. fabarum、A. tropicalis、A. aceti均為首次在菠蘿蜜果醋醋醪中分離得到。

2.4 醋酸菌發(fā)酵性能實(shí)驗(yàn)

2.4.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

由圖5可知,Aa723、Aa847的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在6～60 h之間,其他菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為6～48 h。Aa941的生長(zhǎng)量最大,OD600nm值達(dá)到1.31,其次分別是As1.41、Aa747、Aa844、Aa847和Aa723,說明Aa941在篩選出的5 株菌株中具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力,且與商業(yè)菌株As1.41具有相似的生長(zhǎng)曲線。菌種在對(duì)數(shù)期內(nèi)具有較強(qiáng)的活力和繁殖能力,同時(shí)對(duì)外界刺激的應(yīng)激反應(yīng)較為靈敏[25],因此,選擇48 h為醋酸桿菌種子液培養(yǎng)時(shí)間。

圖5 醋酸菌生長(zhǎng)曲線Fig. 5 Growth curves of acetic acid bacteria

2.4.2 溫度對(duì)發(fā)酵性能的影響

圖6 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)量（A）、產(chǎn)酸量（B）和醇酸轉(zhuǎn)化率（C）的影響Fig. 6 Effect of temperature on OD600 nm (A), acetic acid production (B)and alcohol-acid transform ratio (C) of strains

種屬不同的醋酸桿菌有不同的最適生長(zhǎng)溫度[26]。有研究表明,在一定范圍內(nèi),隨著溫度的升高,醋酸桿菌的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸代謝速率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)[27-28]。由圖6可知,在25～37 ℃范圍內(nèi),除Aa723外,其他5 株醋酸桿菌的生長(zhǎng)量、產(chǎn)酸量和醇酸轉(zhuǎn)換率隨著溫度先升高后下降。Aa723與Aa941、As1.41分別在25、31 ℃時(shí)具有最高的生長(zhǎng)量和產(chǎn)酸量,Aa723、Aa747在28 ℃時(shí)有最高醇酸轉(zhuǎn)換率。在25～31 ℃范圍內(nèi),Aa847、Aa941和As1.41的醇酸轉(zhuǎn)換率變化較小,Aa844的生長(zhǎng)量和產(chǎn)酸量波動(dòng)較小,相比較而言,Aa723和Aa747的在該溫度范圍內(nèi)敏感性較強(qiáng)。Aa941在31、34、37 ℃時(shí)的產(chǎn)酸量均為各醋酸桿菌中最高,分別達(dá)到38.70、35.78、19.79 g/L;在37 ℃時(shí),6 個(gè)菌株均能保持一定的產(chǎn)酸量,但只有Aa941和As1.41的OD600nm值能達(dá)到0.650以上,且能維持較高的醇酸轉(zhuǎn)換率,分別達(dá)到65.10%和63.10%。

對(duì)比國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究,李文等[17]從獼猴桃中篩選出一株耐高溫醋酸桿菌WT08(A. pasteurianus),在36 ℃培養(yǎng)72 h,產(chǎn)酸量為10.65 g/L,相同發(fā)酵時(shí)間,本研究篩選的醋酸桿菌Aa941在37 ℃產(chǎn)酸量為19.79 g/L,明顯優(yōu)于WT08。

2.4.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)發(fā)酵性能的影響

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株生長(zhǎng)量（A）、產(chǎn)酸量（B）和醇酸轉(zhuǎn)化率（C）的影響Fig. 7 Effect of ethanol concentration on OD600 nm (A), acetic acid production (B) and alcohol-acid transform ratio (C) of strains

乙醇既是醋酸菌生長(zhǎng)的能量來源,也是醋酸發(fā)酵的底物[29],但高體積分?jǐn)?shù)乙醇將嚴(yán)重抑制醋酸菌的生長(zhǎng)和代謝速率[30]。由圖7可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的上升,各醋酸桿菌的生長(zhǎng)量基本呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),產(chǎn)酸量和醇酸轉(zhuǎn)換率呈先上升后下降趨勢(shì);各醋酸桿菌在乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)OD600nm值最大,均高于0.950;在乙醇體積分?jǐn)?shù)為4%時(shí)產(chǎn)酸量最高,說明低體積分?jǐn)?shù)的乙醇不利于醋酸桿菌的產(chǎn)酸代謝。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于8%時(shí),6 株菌的生長(zhǎng)值、產(chǎn)酸量和醇酸轉(zhuǎn)換率均受到不同程度的抑制,其中Aa844受到的抑制最為嚴(yán)重,OD600nm值和產(chǎn)酸量分別低于0.400 g/L和10.00 g/L,只有Aa941和As1.41的生長(zhǎng)雖受抑制,但依然保持著較高的產(chǎn)酸量和醇酸轉(zhuǎn)換率。在6 株醋酸菌中,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為4%,Aa941的產(chǎn)酸量最大,達(dá)到36.50 g/L;乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%、8%時(shí),Aa941的產(chǎn)酸量和醇酸轉(zhuǎn)換率均大于其他5 株醋酸菌,分別為30.15 g/L、74.85%和25.11 g/L、74.10%。

對(duì)比國(guó)內(nèi)相關(guān)研究,張志燕等[31]在香醋醋醅中篩選出優(yōu)勢(shì)醋酸菌D-3-4,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%～11%時(shí),產(chǎn)酸量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)上升而下降,產(chǎn)酸量在11%時(shí)受到較嚴(yán)重抑制,與本研究結(jié)果基本一致。李大為等[32]從自然發(fā)酵的蘋果醋中分離出一株高耐受性醋酸桿菌B103(A. pasteurianus),產(chǎn)酸量為35.6 g/L,耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)為7%,本研究篩選出的醋酸菌Aa941(A. pasteurianus)其乙醇體積分?jǐn)?shù)耐受性和產(chǎn)酸量均高于B103。

3 結(jié) 論

本研究通過富集培養(yǎng)、生理生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)和16S rRNA分子生物學(xué)鑒定的方法,對(duì)自然發(fā)酵的菠蘿蜜果醋醋醪中醋酸菌進(jìn)行發(fā)酵特性研究。結(jié)果表明,從菠蘿蜜果醋醋醪中分離鑒定出5 株醋酸桿菌,分別為Aa723和Aa941(A. pasteurianus)、Aa847(A. fabarum)、Aa747(A. tropicalis)以及Aa844(A. aceti),其中不同醋酸桿菌對(duì)溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)的耐受性具有顯著性差異。菌株Aa941發(fā)酵性能最佳,31 ℃連續(xù)發(fā)酵96 h,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為4%時(shí)產(chǎn)酸量最大,達(dá)到38.70 g/L;乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%時(shí),30 ℃發(fā)酵96 h醇酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高,為74.85%。Aa941在8%高乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下,30 ℃發(fā)酵96 h產(chǎn)酸量和醇酸轉(zhuǎn)換率分別為25.11 g/L和74.10%;在37 ℃高溫下生長(zhǎng)良好,乙醇體積分?jǐn)?shù)4%發(fā)酵96 h產(chǎn)酸量和醇酸轉(zhuǎn)換率分別為19.79 g/L和65.10%,其耐乙醇和耐高溫性能優(yōu)于商業(yè)菌種As1.41。醋酸桿菌Aa941能將菠蘿蜜果酒發(fā)酵成具有菠蘿蜜特征香氣的果醋,可作為菠蘿蜜果醋發(fā)酵的菌種,進(jìn)一步豐富了果醋發(fā)酵所需的菌種資源。